氧化应激与Nrf 2在支气管肺发育不良中的机制研究

段蓉蓉 鲁利群

支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)是好发于早产儿的难治性慢性呼吸系统疾病，主要表现为患儿生后28 d内不能在空气环境中维持血氧饱和度大于88%，仍需氧气支持治疗[1-2]，死亡率高达30%以上[3]。BPD的患病风险与出生时胎龄及体质量呈负相关[4]，目前虽有多种治疗方法，包括表面活性剂、产后类固醇和机械通气等[5]，但其预后仍不良，多数BPD幸存者遗留生长发育迟缓、视网膜病变、学习障碍、神经感觉障碍、肺功能障碍等[6-9]。研究[3,5-9]发现，氧化应激和慢性炎症是BPD的2大关键危险因素，而核因子E2相关因子2 (nuclear factor erythroid-related factor 2, Nrf 2)是抗氧化系统的主要调节因子，其通过与抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)作用来控制多种抗氧化酶的表达，并可调节炎症反应，减轻氧化应激损伤，保护肺泡细胞和肺血管，对BPD患儿起到保护作用。本文就氧化应激导致BPD的损伤机制、Nrf 2的激活途径、Nrf 2介导的抗氧化途径对BPD的保护作用进行综述如下。

1 氧化应激在BPD中的作用机制

1.1 氧化应激与BPD的病理改变 氧化应激是因各种内在或外在因素造成的活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成过量或降解减少，导致氧化和抗氧化防御系统不平衡而发生的一系列适应性反应[10]。ROS包括自由基和非自由基含氧分子，参与细胞生长、分化、凋亡和坏死等分子反应，其通过自由基引起的氧化应激和氧化还原反应失衡[11]，对细胞中的核酸、蛋白质、碳水化合物和膜脂等造成损害[7,12]。ROS与包括BPD在内的许多肺部疾病的病理变化都有关，过早暴露于高氧环境和ROS中是BPD的主要危险因素。BPD的病理特征是肺泡简单化、肺微血管发育不良及肺小中血管闭塞、弹性组织增加、炎性因子增加和肺水肿[7,13-16]，主要表现为气道高反应性和阻塞性通气功能障碍[7]，以及肺组织通气损伤导致的肺纤维化[17]，进而致肺功能受损、肺血管过度重构和右心室肌肥大[13]。

1.2 氧化应激致BPD的损伤机制 现有医疗发展水平下早产儿的生存率逐步增高，其中氧疗是早产儿疾病治疗的常用方法。氧作为一种环境刺激物，能调节肺的正常发育，但高氧环境的长期刺激会使ROS积累过量而发生氧化应激，后者通过破坏生长因子信号传导、细胞外基质组装、细胞增殖、凋亡和血管生成等影响肺的发育[18]，甚至引起不可逆转的肺发育异常。

1.2.1 氧化应激致BPD II型肺泡上皮细胞死亡的机制 细胞死亡的3种主要方式包括细胞凋亡、自噬和程序性细胞坏死，3者均可被调控。程序性坏死是因特异性受体被激活后细胞稳态破坏而引起的细胞死亡，调控坏死特异性受体的3个关键蛋白是受体相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1, RIP1)、RIP3和混合系激酶区域样蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein, MLKL)，3者的联合作用可形成坏死性小体信号复合物，导致细胞坏死增加,且细胞坏死和ROS产生密切相关[19-20]。Ⅱ型肺泡上皮细胞(type Ⅱ alveolar epithelial cells, AECⅡ)可调节肺组织体液稳态，促进肺组织重塑。当受到大量氧自由基刺激时，其细胞膜完整性被高氧相关的炎症因子和氧化应激相关产物破坏，导致其细胞功能障碍和发生能量衰竭[21]。Han等[20]研究表明，BPD中高氧暴露后发生氧化应激，引起RIP1、RIP3和 MLKL等促进坏死的关键蛋白表达增加，从而加速肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞发生坏死，ROS产生增加，使肺组织受损。另有研究[7]认为，高氧诱导的氧化应激导致AECⅡ过度凋亡并抑制其增殖，影响AECⅡ在肺组织生长、成熟、创伤修复过程和肺液稳态调节中的作用，从而导致肺损伤，最终发展为BPD。

1.2.2 氧化应激致BPD内质网应激及细胞凋亡的机制 内质网可介导蛋白质的合成、折叠和修饰，折叠使蛋白质获得其功能性三维结构，当蛋白质的折叠需求增加或蛋白质结构受损时，内质网则通过触发未折叠蛋白反应来处理以上情况。在细胞稳态被破坏时，慢性内质网应激会导致ROS的生成增多和炎症因子表达增加，通常会通过依赖或独立于线粒体的途径导致细胞凋亡。Teng等[22]研究发现，内质网对氧化应激敏感，高氧引起的BPD中氧化应激通过内质网应激导致ROS生成增多和炎症反应加重，诱导肺泡上皮细胞凋亡增加，进而损伤发育中的肺组织。

1.2.3 氧化应激加重BPD炎症反应的机制 在氧化应激的情况下，过量的ROS引起巨噬细胞和中性粒细胞过度激活，生成大量炎症相关因子，且可引起ROS进一步释放[23]。因此，高氧可使多种促炎细胞因子激活，刺激肺部的肿瘤坏死因子-α、白细胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)等炎症因子的表达以及中性粒细胞的积累，从而损伤肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞。高氧诱导的BPD中氧化应激通过激活肺血管内皮细胞中依赖于还原性辅酶Ⅱ氧化酶的超氧阴离子的产生使炎症加重，炎性因子的慢性增加引起肺部受损、肺泡死亡细胞增多，导致肺损伤[24]。因此，高氧引发的氧化应激以及因氧化应激加重的肺部炎症是BPD发病的重要因素。

2 Nrf 2的抗氧化应激作用

Nrf 2是一种具有亮氨酸拉链的调控抗氧化系统的快速反应模块蛋白，包含7个不同功能的Nrf 2-ECH同源结构域(Neh1、Neh2、 Ne/3、 Ne/4、 Ne/5、 Ne/6、 Neh 7)。Kelch样ECH相关蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)是维持Nrf 2持续泛素化并调节其降解的蛋白，Neh2结构域包含2个氨基酸序列，其负责与Keap1相互作用以维持Nrf 2的蛋白水平[25]。Nrf 2参与对氧化和外源性应激的反应、线粒体呼吸、干细胞静止、mRNA翻译、自噬等不同的细胞代谢过程,其介导200多个抗氧化酶和清除ROS蛋白的表达，这些蛋白能有效中和或解毒内源性亲电代谢物和环境毒物[12]。研究[26]显示，Nrf 2在细胞核通过与ARE结合来调控超氧化物歧化酶、血红素氧合酶-1(heme oxygenase 1, HO-1)和谷胱甘肽过氧化物酶等多种提供中和外毒素的物质或具有抗氧化应激能力的酶的表达，促进抗氧化反应的发生，减轻氧化应激造成的机体损害，发挥细胞保护的作用。另外，Nrf 2还可通过降低促炎因子的表达来调节炎症反应，其介导的信号通路能减轻高氧导致的肺损伤，对损伤后肺稳态的恢复起到积极作用。

3 Nrf 2在BPD中的保护作用

3.1 Nrf 2介导的抗氧化及其激活途径

3.1.1 Keap1-Nrf 2-ARE通路 在稳态条件下，Nrf 2位于细胞质并与Keap1结合形成复合物，Keap1通过调节Nrf 2的降解使Nrf 2的表达始终维持在一定水平；当处于氧化应激状态时，Nrf 2与Keap1形成的复合物发生分离，Nrf 2随后转移至细胞核并与ARE结合以激活一组细胞保护基因[25,27]。因此，Keap1-Nrf 2-ARE信号通路被认为是体内最重要的内源性抗氧化信号通路[28-29]，这一途径涉及抗氧化防御、氧化还原平衡和解毒等多个细胞代谢过程[30]。

在Keap1-Nrf 2-ARE信号通路中，Nrf 2调控的抗氧化酶HO-1在抵御氧化因素和凋亡引起细胞组织损伤中发挥关键作用。HO是血红素代谢过程中必不可少的酶，HO-1是其3种同工酶中的一种，包括氧化应激在内的多种理化因素均可诱导HO-1的表达，亦称为诱导型HO[31]。HO-1是具有抗氧化应激、减轻炎症和抗凋亡作用的应激蛋白，在血红素代谢过程中将血红素分解为亚铁、一氧化碳和胆绿素，其中血红素和胆绿素分别具有促氧化和ROS清除作用。研究[32]表明，在小鼠高氧肺损伤模型中，低、中剂量的依托咪酯麻醉剂可通过激活Keap1-Nrf 2-ARE通路来上调HO-1的表达，对肺泡上皮细胞和肺毛细血管的具有保护作用；冬虫夏草素同样可以通过激活Nrf 2途径来上调HO-1的表达，减轻脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤的炎症反应，降低肺受损的程度[23]。

3.1.2p62-Keap1-Nrf 2通路及Nrf 2的激活途径 自噬是与氧化应激密切相关的维持机体稳态的重要蛋白质降解途径，自噬受体蛋白p62(sequestosome-1)参与细胞自噬、细胞内信号传递、氧化还原反应等过程，其关键作用是将泛素化的蛋白转运到蛋白酶体中实行降解，ROS的积累可激活p62参与降解受损的细胞器和有害蛋白。p62是Keap1蛋白水平的调控蛋白，在稳态情况下，p62可直接与Keap1结合，使Keap1通过自噬稳定降解，维持在一定水平；应激状态下，磷酸化的p62与Keap1的结合增强，干扰Nrf 2的核易位[28]。

因此，Nrf 2激活途径分为经典途径和非经典途径，经典途径是Nrf 2激活的主要机制，其基础是Nrf 2与Keap1的非活性复合物分离，随后Nrf 2发生核易位；非经典途径则是由p62介导的自噬[30]。Zhao等[28]研究发现，自噬激动剂能够通过抑制p62磷酸化，从而加快Keap1降解使Nrf 2核易位增多，提高Keap1-Nrf 2信号通路的活性，促进下游抗氧化酶的表达，从而增强抗氧化能力，减轻BPD小鼠肺泡结构简单化的程度，表明p62-Keap1-Nrf 2信号通路在减轻氧化应激导致的肺损伤中具有重要作用。

3.2 Nrf 2参与的其他保护途径

3.2.1 抗炎途径 炎症也是BPD形成的独立危险因素，肺泡巨噬细胞通过产生活性氧和包括IL-1β在内的细胞因子来调节炎症反应，促炎症细胞因子IL-1β参与炎症的发生和发展，因而IL-1β能加快BPD的发展进程。硫氧还蛋白还原酶1是Nrf 2激活的抑制剂，在BPD的小鼠模型中，金诺芬药物通过抑制硫氧还蛋白还原酶1来促进脂多糖处理的小鼠肺泡巨噬细胞中Nrf 2的激活，结果IL-1β的表达水平降低，提示Nrf 2能通过降低IL-1β的表达，减轻炎症反应，减慢BPD的发展进程[33]。

3.2.2 抗凋亡途径 微小RNA-125b (microRNA-125b, miR-125b)是一种微小核糖核酸，由miR-125b-1和miR-125b-2组成，可避免内皮细胞在氧化应激下过度凋亡，在细胞的增殖、分化和凋亡过程中扮演着紧要角色。研究[34]证明，在A549肺癌人类肺泡上皮细胞和新生大鼠BPD模型中，Nrf 2受抑制的同时miR-125b也受到同样的抑制，细胞凋亡明显增加，并且Nrf 2可提高新生鼠在高氧条件下的存活率，减轻高氧诱导的肺泡生长抑制，这些结果均提示调控Nrf 2的下游靶点miR-125b，从而减少肺血管内皮细胞的凋亡，有助于预防BPD的发生。

此外，PI3K/Akt通路是调节细胞生命历程的重要信号通路。在应激状态下，苏氨酸激酶(Akt)被激活，通过磷酸化促凋亡蛋白以避免激活细胞凋亡途径，在促进细胞存活方面发挥着重要作用。研究[35]认为，Nrf 2参与的其他保护性途径中， PI3K/Akt信号通路在肺上皮细胞Nrf 2的激活中是必要的，高氧过程中 PI3K/Akt通路被抑制，Nrf 2靶基因的表达同样受到抑制，并伴随肺损伤和肺部炎症的加重，这表明激活 PI3K/Akt-Nrf 2信号通路可通过减少细胞凋亡来减轻高氧诱导的肺损伤和炎症。

4 小结与展望

氧化应激导致AECⅡ和肺血管内皮细胞过度凋亡和坏死、促炎因子的增加，以及氧化应激导致的内质网应激使肺泡上皮细胞凋亡增加，均是BPD发生的重要原因。Nrf 2作为抗氧化系统最主要的调控因子，通过介导Keap1-Nrf 2-ARE、p62-Keap1-Nrf 2和PI3K/Akt-Nrf 2等信号通路诱导抗氧化酶或抑制凋亡基因的表达，并通过调控抗炎反应减轻BPD肺泡简单化和肺微血管发育不良程度，对BPD患儿起保护作用。目前，BPD中氧化应激引起的内质网应激致BPD的损伤机制、PI3K/Akt-Nrf 2通路及Nrf 2参与的抗凋亡作用均未完全阐明，相信随着研究的不断深入，将为Nrf 2相关抗氧化应激治疗BPD应用于临床提供更多理论支持。