组蛋白甲基转移酶EZH2 在宫颈癌中的研究进展

王昭娣，王悦

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，据国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）调查统计，2020 年预计宫颈癌新发病例为604 127 例，新发死亡病例为341 831 例，均占女性癌症的第4 位[1]。早期宫颈癌预后良好，晚期预后差且易复发、转移及耐药，这些是宫颈癌治疗中的难题。除了传统手术治疗、放疗及化疗外，肿瘤免疫治疗和靶向治疗也展现出较好前景。

表观遗传学指基于非基因序列改变所致基因表达水平的变化，主要包括组蛋白修饰、DNA 修饰、非编码RNA 和核小体重塑等[2]。组蛋白甲基化是表观遗传学中的重要一环，其中果蝇zeste 基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）能通过介导H3K27 甲基化，使靶基因的表达下调或沉默，并与多种肿瘤的发生、发展以及不良预后密切相关[3-4]。探索EZH2 在宫颈癌中的作用及机制，有助于寻找新的分子标志物，为宫颈癌的诊断及治疗提供依据。现对EZH2 在宫颈癌研究中的最新进展进行综述。

1 EZH2 结构及功能概述

EZH2 最早在1996 年被发现，最终被定位于染色体7q35 位点。EZH2 蛋白（含有746 个氨基酸残基），包括20 个外显子和19 个内含子，长度41～323 bp和0.15～17.7 kb 不等，该基因的互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）序列与果蝇zeste 基因的增强子有高度同源性。EZH2 蛋白包含4 个高度保守的结构：氨基（N）端的Ⅰ区、Ⅱ区、半胱氨酸富集区和羧基（C）端的SET 结构域[5]，SET 结构域可由S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-Adenosyl-Methionine，SAM）提供甲基，催化组蛋白H3K27 甲基化。

多梳家族蛋白（polycomb-group proteins，PcGs）以多梳抑制复合体（polycom repressor complex，PRC）的形式在生物体内发挥抑制基因转录和沉默基因的作用，PRC 有维持复合物（PRC1）和起始复合物（PRC2）2 种主要形式。PRC2 由4 种核心组分构成：EZH2、胚胎外胚层发育蛋白（embryonic ectoderm development，EED）、zeste 基因抑制子（suppressor of zeste 12，SUZ12）和视网膜母细胞瘤结合蛋白46/48（retinoblastoma -associated proteins 46/48，RbAp46/48）[6]。EZH2 是具有催化活性的亚基，在EED 和SUZ12 的辅助作用下通过C 端的SET 结构域催化H3K27 甲基化，抑制或沉默靶基因。研究表明EZH2的高表达与肿瘤的恶性行为密切相关[7]。

2 EZH2 表达的临床意义

有研究探讨了EZH2 在宫颈癌中的表达及临床意义。Azizmohammadi 等[8]选取39 例宫颈鳞癌组织和对应癌旁组织，通过实时定量聚合酶链反应（realtime quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）和免疫组织化学技术发现癌组织中EZH2 的mRNA水平（P=0.003）和蛋白水平（P=0.002）均显著高于癌旁组织，EZH2 表达与国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期、分化程度和淋巴结转移呈正相关（P＜0.05）。腺癌和腺鳞癌约占宫颈癌病理类型的20%～25%，有研究共纳入宫颈腺癌54 例、良性病变32 例和正常腺上皮样本66 例，结果显示与正常和良性病变组织相比，宫颈腺癌中EZH2 的表达显著增高（P＜0.05）[9]。唐梅等[10]纳入了更多组织样本，包括174 例宫颈癌（鳞癌143 例、非鳞癌31 例）、62 例宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）以及40 例正常宫颈组织，通过免疫组织化学法发现宫颈癌组EZH2 的阳性表达率明显高于CIN 组和正常组（73.0% vs.46.8%vs.7.5%，P＜0.05）；宫颈癌组中EZH2 表达除了与分期、淋巴结转移和分化程度有关外，还与肿瘤浸润深度有关（P＜0.05），与年龄、病理类型、肿瘤大小无关（P＞0.05）；此外，EZH2 阳性患者的无进展生存期[progression free survival，PFS，（53.7±3.6）个月vs.（62.8±2.4）个月，P＜0.01]和总生存期[overall survival，OS，（56.2±3.0）个月vs.（64.2±1.9）个月，P＜0.01]均短于EZH2 阴性宫颈癌患者，多因素分析结果显示此分子标志物阳性可能是影响预后的独立危险因素（OR=1.483，95%CI：1.406～1.859，P＜0.05）。但是也有研究通过免疫组织化学法分析117 例宫颈鳞癌组织发现EZH2 表达与FIGO 分期（P=0.100）或淋巴结转移（P=0.564）无显著相关性[11]。更多的研究表示病理分期较晚以及有淋巴结转移时宫颈癌患者EZH2阳性率显著更高[10，12-13]。目前测定组织中EZH2 蛋白阳性主要使用单一免疫组织化学法，同时免疫组织化学的结果与抗体的选择、组织的选取以及结果判读等密切相关，这些因素可能导致研究结果之间的差异。未来研究还可以通过运用蛋白质印迹法（Western blotting）以及在mRNA 水平进一步探索EZH2 在宫颈癌中表达的意义。

3 EZH2 的促瘤作用及相关机制

3.1 EZH2 促进细胞增殖、侵袭及迁移Chen 等[14]通过基因编辑及短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）技术上调或下调EZH2，发现EZH2 促进宫颈癌细胞的增殖和肿瘤形成。该研究的荧光素酶报告实验提示EZH2 能够特异性结合到Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）通路抑制剂糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）和TP53 的启动子上。免疫组织化学法提示EZH2 表达与βcatenin、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）和c-myc 表达呈正相关（P＜0.05）。EZH2 通过GSK-3β 和TP53 的表观遗传沉默激活Wnt/β-catenin 通路，促进宫颈癌细胞增殖和肿瘤形成。冀静等[15]用RNA 干扰EZH2表达后，宫颈癌细胞周期阻滞于G1/S 期，增殖明显受抑制，p21 蛋白水平明显升高，提示沉默EZH2 基因可能通过上调p21 诱导C33A 细胞阻滞于G1 期，从而抑制宫颈癌细胞增殖，此研究从另一角度证实EZH2 的促肿瘤增殖作用。

EZH2 在宫颈癌淋巴结转移及深部浸润时表达升高，可见EZH2 能够促进肿瘤侵袭及迁移。Ding等[16]发现，使用EZH2 抑制剂GSK343 后，宫颈癌肿瘤细胞中上皮标志物E-钙黏蛋白上调，间充质标志物N-钙黏蛋白和波形蛋白下调，可见EZH2 通过调控上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）来促进宫颈癌的转移及侵袭。另有研究发现用RNA 干扰技术抑制EZH2 后，宫颈肿瘤细胞的基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）下调，迁移侵袭能力降低，可见EZH2 的促进肿瘤转移作用还可能通过调控MMP-2 基因来实现[17]。

有研究发现EZH2 的上游基因，可以通过对EZH2表达的调控影响宫颈癌的增殖及转移。微小RNA-137（miR-137）及miR-214 在宫颈癌中低表达，其下调可解除对下游靶基因EZH2 表达的抑制，促进宫颈癌细胞体内外的增殖和迁移[18-19]。另外，研究发现长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）LINC01535 能够结合miR-214，解除miR-214 对其靶基因EZH2 的抑制作用，上调EZH2 蛋白的表达，发挥生物学作用[20]。

非编码RNA 能将EZH2 定向募集到靶基因上，EZH2 通过使靶基因H3K27 甲基化在表观遗传学水平修饰靶基因，进而导致靶基因抑制或沉默。目前已有关于与宫颈癌细胞增殖或迁移、侵袭相关非编码RNA 的研究。lncRNA ARAP1-AS1 通过募集EZH2沉默双特异性磷酸酶5（dual-specificity phosphatase 5，DUSP5）的表达，激活ARAP1-AS1/EZH2/DUSP5轴促进SiHa 细胞增殖和迁移[21]。lncRNA PVT1 将EZH2 招募到miR-200b 启动子上，增加该区域组蛋白H3K27 三甲基化水平，并抑制miR-200b 表达，导致宫颈癌细胞增殖和迁移[22]。lncRNA SNHG7 能够促进宫颈癌细胞增殖，研究发现其机制是招募EZH2与Dickkopf 同源物1（Dickkopf-1，DKK1）启动子的结合，下调DKK1 基因的表达，从而激活宫颈癌中Wnt/β-catenin 信号传导途径[23]。环状RNA（circular RNA，circRNA）AGFG1 在宫颈癌中过表达，与不良预后密切相关，通过募集EZH2 表观遗传修饰下调p53 发挥致癌作用，在体外影响SiHa 和HeLa 细胞的增殖能力[24]。circ_0019435 可导致EZH2 向DKK1和人第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene，PTEN 基因）启动子方向募集，下调DKK1 和PTEN 基因的表达，激活Wnt/β-catenin途径，增加HeLa 和SiHa 细胞体外的增殖、侵袭、迁移和EMT 作用[25]。在宫颈癌中，EZH2 参与的非编码RNA 的募集作用，该定向募集对宫颈癌细胞其他恶性生物学行为的作用需要更多研究去验证。

3.2 EZH2 促进肿瘤血管生成EZH2 高表达时宫颈恶性肿瘤微血管密度（microvascular density，MVD）更高。Fathy 等[26]通过对54 例宫颈癌组织免疫组织化学分析发现，EZH2 和内皮素-1（endothelin-1，ET-1）的表达与MVD 呈正相关（P＜0.01），EZH2 可作用于ET-1 促进肿瘤血管的生成。此外，还有研究发现宫颈病变[包括65 例宫颈癌和90 例宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）]患者组织中EZH2 与血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）的表达呈正相关（r=0.857，P=0.000），EZH2 还可作用于VEGF-C 促进肿瘤血管的生成[27]。

3.3 EZH2 抑制细胞凋亡EZH2 在多种肿瘤中与细胞凋亡密切相关。在宫颈癌中的研究发现，用EZH2 抑制剂3-去氮腺嘌呤（3-deazaneplanocin A，DZNep）处理后，C33A 细胞（6.57±0.25 vs.1.35±0.12，P＜0.05）和SiHa 细胞（5.04±0.13 vs.0.75±0.11，P＜0.05）的凋亡比例显著高于未经DZNep 处理的对照组，Western blotting 结果显示凋亡蛋白B 细胞淋巴瘤/白血病-xL（B cell lymphoma/leukemia-xL，BclxL）表达下调，促凋亡蛋白B 细胞淋巴瘤-2 促细胞凋亡（B cell lymphoma-2 interacting mediator of cell death，Bim）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）表达上调，可见在宫颈肿瘤中EZH2 也与细胞凋亡有关[28]。lncRNA SNHG8 通过增加回复引导半胱氨酸丰富蛋白Kazal 基元（reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs，RECK）启动子区域中EZH2 和H3K27me3 的富集，表观遗传修饰RECK 使该基因沉默，增加了宫颈癌细胞的抗凋亡作用[29]。

3.4 EZH2 诱导顺铂耐药宫颈癌的铂耐药一直是治疗的难题，EZH2 也参与肿瘤的铂耐药。与HeLa细胞相比，顺铂耐药宫颈癌细胞（HeLa/DDP）中EZH2 的表达更高，运用shRNA 技术敲低HeLa/DDP细胞的EZH2 表达，接着用顺铂处理细胞48 h，与未敲低EZH2 表达的HeLa/DDP 细胞（34.88 μg/mL）相比，IC50值显著降低（19.09 μg/mL，P＜0.01），进一步研究发现抑制EZH2 后可能上调Dicer 酶而逆转宫颈癌的顺铂耐药[30]。另有研究表明miR-217 在SiHa/DDP 细胞中低表达，上调miR-217 可部分逆转顺铂耐药性并且下调EZH2 的表达，其可能通过作用于EZH2 参与宫颈癌顺铂耐药的调控，具体调控机制尚待进一步研究[31]。

3.5 EZH2 促进肿瘤免疫逃逸T 细胞免疫球蛋白黏蛋白3（T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3）和半乳糖凝集素9（galectin-9）的结合可引起免疫耐受[32]。Zhang 等[33]发现宫颈癌中EZH2 可直接与DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）相互作用，抑制DNMT 的表达，降低Tim-3/galectin-9 启动子区域甲基化水平，从而促进了该通路上调，引起免疫耐受并导致癌变过程中的免疫逃逸。但EZH2 促进肿瘤免疫逃逸的机制仍需进行更多研究加以证明。

3.6 EZH2 与人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的关系HPV 是宫颈癌发生发展最主要的危险因素。研究显示在HPV16 阳性的宫颈癌细胞中沉默E7 基因，EZH2 的表达会显著下调；HPV16 E7 通过介导口袋蛋白（pocket protein）释放转录因子E2F（E2F transcription factor），在转录水平上激活EZH2的表达，而E6 的刺激作用较弱；同时EZH2 能够促进HPV 阳性的宫颈癌细胞的增殖以及凋亡抵抗[34]。此后有研究发现HPV18 E6 或E7 过表达均可导致EZH2 和H3K27me3 表达水平增加；HPV18 E6 和E7可能通过叉头框蛋白M1（forkhead box protein M1，FOXM1）和E2F-1 与EZH2 启动子区相互作用，上调EZH2 和H3K27me3 的表达[33]。可见EZH2 能够与HPV 蛋白相互作用，影响宫颈癌的进展，进一步提示EZH2 可以作为宫颈癌新的治疗靶点。

4 EZH2 抑制剂

目前研究已证实EZH2 介导表观遗传修饰的失调在癌症的发生发展中的作用，EZH2 可作为新型抗癌靶点。目前一些高选择性的小分子EZH2 抑制剂已经研制出来并用于多种肿瘤的实验室以及临床研究。GSK126、PF06821497 和CPI-1205 等抑制剂在淋巴瘤、非小细胞肺癌以及前列腺癌等方面已经进入Ⅰ期临床试验阶段；EPZ-6438 是一种选择性可口服的EZH2 抑制剂，由美国Epizyme 公司研发，2020年该药经美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准上市，对多种恶性肿瘤的抗肿瘤活性和预后效果均表现良好[35]。

目前在宫颈癌中EZH2 抑制剂还在细胞水平研究阶段，如GSK343 和DZNep。GSK343 能够通过竞争抑制甲基供体SAM 来发挥作用。如GSK343 在作用浓度为50 μmol/L 时，处理HeLa、SiHa 细胞48 h、72 h 能够显著抑制HeLa 细胞的增殖以及迁移能力，并证明其抑癌作用可能是通过抑制HeLa 细胞EMT过程来实现的[16，36]。DNZep 能抑制S-腺苷高半胱氨酸水解酶（S-adenosy-L-homocysteine hydrolase，SAHH）活性，使失活的S-腺苷高半胱氨酸（Sadenosy-L-homocysteine，SAH）积聚，进而抑制EZH2的活性。利用DZNep 抑制C33A、SiHa 宫颈癌细胞中EZH2 的表达48 h 后，能够诱导宫颈癌细胞早期凋亡，其对两种细胞的IC50 分别为4 μmol/L 和6 μmol/L[28]。用不同浓度DZNep（1、5 和10 μmol/L）处理铂耐药HeLa/DDP 细胞后，Western blotting 显示EZH2 和H3K27me3 的表达水平降低，随着时间的增加，四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测的细胞活力显著降低[30]。可见EZH2 抑制剂有望成为治疗恶性肿瘤的新兴手段，具有良好的发展前景。

5 结语与展望

组蛋白甲基转移酶EZH2 在宫颈癌中高表达，与预后不良有关。宫颈癌中EZH2 参与肿瘤的增殖、迁移、侵袭、血管生成、耐药以及免疫逃逸等作用。研究表明EZH2 有望作为宫颈癌新的生物标志物，有助于宫颈癌的早期诊断、预后评估和疗效评价。但是目前关于EZH2 在宫颈癌中作用及机制的研究较少，未来将EZH2 作为药物靶点，开发出高效、低毒性、高选择性的EZH2 靶向药物可作为发展方向之一，同时也需要进行更多临床实验来验证该靶向药物和生物标志物的诊疗效果。基于单一药物作用的有限性，还可以探索EZH2 靶向药联合传统治疗的疗效与安全性，从而制定出更好的治疗方案。