高效液相色谱法分析反应液中1-溴芴酮含量

徐炫宗

（广东阿格蕾雅光电材料有限公司，广东佛山 528333）

轻工业与人们的日常生活息息相关，芴酮类化合物在轻工业领域应用广泛，比如生产含芴环氧树脂的高级塑料、洗涤剂、颜料、透明尼龙等[1-2]，也应用于医药行业、吸附温室气体二氧化碳[3]、太阳能发电上[4]以及新型有机电致发光（OLED）上[5]；关于芴酮类化合物的分析检测，主要用的色谱分析法[6]，但目前还没有关于1-溴芴酮分析方法的报道；在化学合成生产中，及时、准确地获得反应液中目标物的含量是提高产率、降低成本的前提，由于反应液中成分复杂，很容易对分析结果造成干扰，所以想获得准确可靠的分析结果需要科学合理的检测方法。本文依据GB/T 16631-2008《高效液相色谱法通则》，为分析反应液中1-溴芴酮含量制定了科学的分析方法，对指导生产有重要意义。

1 实验前准备部分

1.1 实验试剂与仪器

试剂：1-溴芴酮标样（纯度为98%，购自北京时嘉科技发展有限公司），色谱级甲醇（购自默克公司），分析纯级二氯甲烷（购自大茂化学试剂厂），2 mL 棕色样品瓶（购自浙江哈迈科技有限公司），不同规格的容量瓶、玻璃离心管、烧杯、玻璃棒、各种量程的吸量管等其他实验室常用器皿。

仪器：带DAD 检测器的安捷伦HPLC1260（安捷伦科技有限公司生产），德国SIGMA2-16P 离心机，赛多利斯Sartorius BSA224S-CW 分析天平（量程220 g，精度0.1 mg），超纯水机（美国millipore，超纯水电阻率为18.2 兆欧），岛津HPLC-20AB，带UV 检测器（日本Shimadzu 公司），IKA HS 260 摇床，超声波清洗器KQ2200E（购自昆山舒美）。

1.2 标准溶液配制

称得标样25.7 mg 于25 mL 烧杯中，加适量二氯甲烷溶解后转移至25 mL 容量瓶，用二氯甲烷少量多次把烧杯残余的标样洗至容量瓶后再以二氯甲烷定容至刻度并摇匀，按照98%纯度折算后得到浓度为1 007.4 mg/L 的母液，分别移取上述母液1.0 mL、0.8 mL、0.5 mL、0.3 mL、0.1 mL 于10 mL 容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度后摇匀，得到浓度为100.7 mg/L、80.6 mg/L、50.4 mg/L、30.2 mg/L、10.1 mg/L 的系列标液，再分别移取浓度为10.1 mg/L 的标液5 mL、1 mL于10 mL 容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度后摇匀，得到浓度为5.0 mg/L、1.0 mg/L 的标液。

1.3 样品配制

称取100.6 mg 待测反应液于20 mL 具塞离心管中，加入5 mL 二氯甲烷手摇或者超声至样品全溶后再加入10 mL 纯水，转移至摇床以100 rpm 萃取5 min 后以7 000 rpm 离心5.0 min分层，用吸管将底部有机层转移至25 mL 容量瓶中，以二氯甲烷重复萃取2 次，合并有机层后用二氯甲烷定容至刻度后摇匀，移取0.5 mL 于25 mL 容量瓶中，用二氯甲烷定容后摇匀，取适量过有机滤膜装瓶，得到浓度为80.5 mg/L 备测样液，同时制作样品空白试液。

2 实验部分

2.1 检测波长的选择

设置流动相为甲醇，色谱柱为HITACHI LaChrom C18 4.6×250 mm 5 μm，流速为1.0 mL/min；柱温为35℃，进样量5 微升，检测器（DAD）波长采集范围设置为200 nm～460 nm，采集时间为15 min，进一针浓度为50.4 mg/L 的标液，结果显示主峰保留时间为3.95 min，从DAD光谱图可知，1-溴芴酮在209.38 nm、254.29 nm、261.48 nm 和322.46 nm处有吸收峰，其中吸收强度最大的是261.48 nm，并且这个波长远离液相色谱常用溶剂紫外截止吸收波长，后续分析检测波长设置为261 nm。

2.2 色谱柱选择

以甲醇为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为35℃，进样量5 微升，检测器波长为261 nm，采集时间为15 min，进浓度为50.4 mg/L 的标液，考察了1#柱：HITACHI LaChrom C18 4.6×250 mm 5 μm；2#柱：Inertsustain C18 4.6×250 mm 5 μm；3#柱：Agilent ZORBAX SB-C18 4.6×250 mm 5 μm；4#柱：Inertsil ODS-SP 4.6×250 mm 5 μm四根色谱柱，比较主峰保留时间、对称因子、柱压、理论塔板数4 个主要指标，结果1#柱：3.95、0.92、62.8、12 258；2#柱：3.65、1.01、55.9、15 264；3#柱：3.81、0.97、69.2、11 397；4#柱：2.98、0.96、51.5、10 652；从以上数据可以看出，四根色谱柱效果接近，综合考虑Inertsustain C18 4.6×250 mm 5μm 最佳，将其定为分析用色谱柱。

2.3 流动相优化

色谱柱为Inertsustain C18 4.6×250 mm 5 μm，流速为1.0 mL/min，柱温为35℃，进样量5 微升，检测波长设置为261 nm，用不同极性流动相进由1.3 小节方法制得的样品溶液，流动相设置如下：甲醇、甲醇-水=95-5、甲醇-水=9-1、甲醇-水=8-2、甲醇-水=75-25、甲醇-水=7-3；用最强洗脱流动相（甲醇）确定最大保留杂质，然后调整流动相逐渐分离主峰包裹杂质以及让主峰与前后第一个杂质的分离度满足＞1.5 的要求，发现，当流动相为甲醇-水=8-2（V-V）时，杂质分离度满足要求，在此基础上继续降低流动相洗脱能力也没发现主峰里有包裹杂质分离出，但在本色谱条件下主峰是否为单一的1-溴芴酮成分还需要转移到带DAD 检测器的仪器继续验证，然后调出DAD 检测器测得的主峰±5%和±60%峰高处光谱，从结果可以看出这4 点的光谱轮廓重合度高，再检查主峰光谱纯度为997，纯度很高，即确定主峰未包裹杂质。

根据以上的验证结果，为了提高分析效率，最终分析条件为：色谱柱为Inertsustain C18 4.6×250 mm 5 μm，流速为1.0 mL/min；柱温为35℃，进样量5 微升，检测波长设置为261 nm，设置体积比梯度流动相：甲醇-水=8-2（0 min～12 min），再从12 min～15 min 逐渐变为纯甲醇后保持8 min 结束采集，后运行5 min，总分析时间为28 min。

2.4 标准曲线绘制

用最终分析方法，进1.2 小节配制的系列标准溶液（由于标准物质纯度高，为节省分析时间，绘制标准曲线时后面的梯度洗脱程序可以省略），以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得Y=19.741X-17.235，相关系数R2=0.999 8，在1 mg/L～100 mg/L 浓度范围内线性关系良好。

2.5 样品萃取次数确定

用1.3 小节样品配制方法对同一个样品以每次5 mL 二氯甲烷进行多次萃取，并把每次萃取的二氯甲烷分别定容，共进行了五次萃取，制得的样品A、样品B、样品C、样品D 和样品E，进行6 次平行实验，用最终分析方法从样品E 至样品A依次进样，计算得到的结果样品E～样品A 平均含量分别为：0.32%（RSD：7.8%）、0.67%（RSD：4.6%）、1.39%（RSD：2.5%）、6.57%（RSD：1.4%）、55.2%（RSD：0.7%），可见，当萃取三次后，目标物萃取率达到98%，定萃取次数为3 次。

2.6 方法学验证

2.6.1 方法稳定性

将同一个样品分别在第1 天、第2 天、第3 天各进行6 次平行检测，结果显示第1 天平均含量为64.60%，RSD 为0.7%；第2 天平均含量为64.62%，RSD 为1.0%；第3 天平均含量为64.86%，RSD 为0.5%；可见同一天6 次平行测定的结果RSD 均小于1.5%，三天结果平均值为64.63%，相对平均偏差为：0.03%，方法稳定性良好。

2.6.2 方法准确性

在样品中分别添加5%、20%、50% 的1-溴芴酮标物，各做6 次平行，结果显示：加标量为5%时，平均回收率为97.70%，RSD 为1.0%；加标量为20% 时，平均回收率为98.29%，RSD 为0.5%；加标量为50% 时，平均回收率为99.05%，RSD 为0.9%，可见总体回收率均在96.7%～99.9%之间，回收率良好，方法准确性高。

3 实验结论

对于检测成分复杂的反应液中1-溴芴酮含量，先经水洗去除酸碱、无机盐等可能会破坏仪器和色谱柱的组分，再用二氯甲烷萃取水相三次可让目标物萃取率达到98%以上，然后用HPLC-UV 外标法检测含量，通过设置合适检测波长、色谱柱、调整流动相比例等达到杂质分离和缩短分析时间的目的，最终得到稳定性好、准确度高的HPLC-UV 法，为反应液中1-溴芴酮含量测定提供了科学可靠的分析方法，对提高生产效益有着积极的意义。