超声辅助-分散液液微萃取结合超高效液相色谱——串联质谱分析马尿中痕量氨鲁米特

陈 茜，马智超

（武汉商学院马科学研究及马匹违禁物品检测中心，湖北武汉 430056）

芳香酶是生物体内催化雄激素前体转化为雌激素的关键限速酶，而芳香酶抑制剂可以特异性地降低芳香酶的活性，抑制雄性激素的芳构化，从而有效阻断雌二醇的合成，降低生物体内雌激素水平，引发性类固醇负反馈，促使下丘脑促性腺激素释放激素和黄体生成素分泌增加，从而刺激睾酮的生物合成和分泌[1]。因此，在赛马运动中，滥用芳香酶抑制剂被认为是间接服用雄激素的一种手段。国际马术联合会（Federation Equestre Internationale，FEI）公布的《2019国际马联兴奋剂禁用清单》中明确规定芳香酶抑制剂作为激素与代谢调节中的一类，属于赛内外均禁用的物质[2]。氨鲁米特（Aminoglutethimide）是第一代非甾体类芳香酶抑制剂，其代谢途径主要以50%的原型随尿排出，因此氨鲁米特在马术兴奋剂检测中以尿检为主。在WADA的技术文件中规定，芳香化酶抑制剂类药物的最低检测能力要求（MRPL）为20ng/mL，但是对于阳性样品的判定未设定下限，这代表对检测灵敏度的要求越来越高[3]。

国内外研究小组已相继报道过多种检测氨鲁米特的方法，Mareck等开发了GC/MS法对尿液中氨鲁米特进行鉴定的方法[4]，Kang等用LC-MS/MS法对包括氨鲁米特在内的抗雌激素物质进行兴奋剂筛查[5]，然而上述方法对尿液的前处理方法一般采用酶解后提取的方法，由于尿液组成复杂、基质干扰大，传统的富集方法会存在耗时长、富集效率低、响应灵敏度低、有机溶剂消耗大等缺点。近年来Lai等合成了分子印迹纳米微球进行固相萃取富集人尿中的氨鲁米特并结合HPLC法进行测定[6]，选择性和灵敏度有所提高，但过程较为烦琐，成本高，易交叉污染。

分散液液微萃取（DLLME）是一种操作方便、设备简单、价格经济、节约时间、环境友好且具有高富集率的前处理方法，自2006年Rezaee提出以来，已广泛应用于食品分析、农药残留分析、药物分析、毒品分析等领域[7-9]。根据文献调研，未见报道采用DLLME前处理方法从马尿样本中提取和检测氨鲁米特的研究。因此，本文旨在建立一种超声辅助分散液液微萃取结合超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（UA-DLLME-UPLC-MS/MS）方法，用于痕量测定马尿中的氨鲁米特，为国内马术运动检测氨鲁米特提供高灵敏检测方法。

1 实验部分

1.1 试剂

氨鲁米特标准品购自美国Selleck公司；甲喹酮标准品购自上海Anpel公司；乙腈，甲醇，甲酸（LCMS级）均购自美国Themo公司；异丙醇，四氢呋喃（HPLC级）均购自上海Macklin公司；四氯乙烯、氯苯、邻二氯苯，四氯化碳，溴乙烷，溴苯（分析纯）均购自上海Macklin公司；二氯甲烷，二硫化碳（分析纯）均购自上海Aladdin公司；空白尿样来自武汉商学院国际马术学院的无药物滥用史的实验马。

1.2 仪器

TSQ Altis Plus三重四极杆质谱仪（美国Themo Fisher Scientific公司）；超纯水机（美国Millipore公司）；台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，5810R）；超微量天平（德国Sartorius公司）；pH计（德国Sartorius公司，PB-30L）；漩涡混匀器（德国IKA公司，Vortex 3）；超声清洗仪（中国昆山舒美公司，KQ-100 VDV）；金属浴氮吹仪（武汉恒信世纪科技有限公司）。

1.3 色谱条件

色 谱 柱 ：Thermo Hypersil Gold C18柱（2.1mm×100mm×3mm）；流动相：A相为0.1%（体积分数，下同）甲酸水，B相为乙腈；梯度洗脱程序：0 ~ 2.0min，保持5%B；2.0~6.0min，从5%B变为95%B，6.0~8.0min，保持95%B，8.0~8.1min，从95%B变为5%B，8.1~10.0min，保持5%B；流速：0.3mL/min；进样量：5.0μL；时间：10min；柱温：30 ℃。

1.4 质谱条件

多反应离子监测（MRM）；离子化方式：电喷雾（ESI）；离子极性：正离子模式；正离子扫描，喷雾电压3 500V；鞘气：30Arb；辅助气体：10Arb；离子传输管温度：350 ℃；雾化温度：400 ℃；氨鲁米特的定量离子对、定性离子对、碰撞能量分别为233.00/188.04（m/z）、233.00/146.00（m/z）、14.86/20.96（eV），甲喹酮的定量离子对、定性离子对、碰撞能量分别为251.10/91.08（m/z）、251.10/132.03（m/z）、35.58/26.82（eV）。氨鲁米特和甲喹酮的保留时间分别为4.30、6.20min。

1.5 标准溶液和阳性尿的制备

标准溶液：准确称取氨鲁米特标准品1.0g（精确至0.0001g），加入10.0mL乙腈配制成1.0mg/mL的标准储备溶液，于-80℃下储存，再依次按比例稀释成100ng/mL的标准工作溶液，于4℃下储存备用。准确量取1.0mL甲喹酮标准品溶液（1.0mg/mL），加入10.0mL甲醇配制成0.1mg/mL的内标储备溶液，于-80℃下储存，再依次按比例稀释成100ng/mL的内标工作溶液，于4℃下储存备用。

阳性尿：取定量氨鲁米特标准工作溶液加入空白尿样，配制一系列浓度的阳性尿用于DLLME的优化和方法验证。

1.6 样品预处理

精确吸取3mL阳性尿于15mL尖底离心管中，加入50µL甲喹酮内标工作溶液，用约150µL 1mol/L氨水溶液调节pH至10.5，将400µL邻二氯苯和500µL四氢呋喃的混合物用1mL胰岛素注射器快速注入样品溶液，在整个样品中分散形成了非常细小的液滴，然后使用超声频率80Hz超声处理1min形成均匀的乳浊液体系，接着在4 000r/min下4℃离心10min，上层用移液枪除去水相并弃去，下层沉淀相在40 ℃的水浴下氮吹近干，用1mL流动相（乙腈-0.1%甲酸，5∶95，体积分数）复溶。最后，用0.22µm尼龙滤膜过滤上述溶液，用于UPLC-MS/MS上样分析。

2 结果与讨论

为获得较高的萃取回收率，需进行各项因素的优化实验，包括萃取剂和分散剂的种类、体积比，样品的pH、离子强度、超声时间和超声频率。在本次优化过程中，马尿样品固定为3mL，氨鲁米特和内标甲喹酮的浓度固定为5ng/mL。无特殊说明，所有数据点做三次平行实验。

2.1 萃取剂与分散剂的选择

选择合适的萃取剂-分散剂组合是提高萃取效率的关键，因此本实验选用二氯甲烷、四氯化碳、四氯乙烯、氯苯、邻二氯苯、溴乙烷、溴苯和二硫化碳作为萃取剂，甲醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃作为分散剂，进行样本提取回收率的考察，以选取最佳组合。结果显示，当分散剂为四氢呋喃时，相比分散剂，回收率普遍较高，其中氯苯和邻二氯苯的平均回收率分别为96.2%和97.7%，综合考虑选择萃取剂-分散剂组合为邻二氯苯-四氢呋喃。

2.2 萃取剂与分散剂体积比的确定

为找到最佳萃取剂与分散剂体积比，固定分散剂的体积为500mL，依次增加萃取剂的体积，控制两者之间的比例为1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5、6∶5、7∶5、8∶5、9∶5、10∶5，考察它们对氨鲁米特回收率的影响，发现回收率随萃取剂体积的增加而提高，当萃取剂与分散剂的体积比达到4∶5时，回收率最高，随后回收率值保持较高水平。考虑到节省试剂和氮吹浓缩的时间，最终选择萃取剂与分散剂体积比为4∶5进行后续优化实验。

2.3 pH影响

氨鲁米特的pKa为11.6，因此，应将样品调整到碱性状态，这样可降低氨鲁米特在水中的溶解度。为确定最佳pH，使用1mol/L氨水调整样品溶液的pH至 5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5。 随 着pH的增加，萃取率增加，直至pH为10.5时萃取率最高。当 pH >10.5时，pH的萃取率降低，因为当pH为4.0时，氨鲁米特更多处于分子状态，有利于向有机相转移，增大萃取率。因此，选择pH为10.5进行下一步的优化。

2.4 盐的影响

为了研究盐添加的影响，本实验按0、5%、10%、15%、20%比例添加NaCl来考察萃取效果。实验发现，随着NaCl用量的增多，离心后得到的沉淀相体积有着明显的降低，这说明盐的添加提高了萃取剂在水溶液中的溶解度。萃取后得到的回收率数据也证明了这点，随着NaCl添加量的增加，萃取率持续降低。因此，后续实验中不添加盐。

2.5 超声时间及频率的影响

本实验考察了0~5min时间萃取率的变化，萃取率在1min达到最大，随着时间的增加，萃取率逐渐降低，这可能是因为长时间超声会造成超声仪器内以及萃取容器内的温度升高，加速萃取溶剂的挥发，损失部分待分析物。因此，选择超声时间为1min作为最优条件。

进一步考察了三种不同超声频率45Hz、80Hz、100Hz对3个平行马尿样品中氨鲁米特的提取效果，结果表明，超声频率对萃取率基本无影响，但80Hz下RSD最低。因此，考虑到萃取过程的重现性和稳定性，超声频率选择80Hz。

2.6 方法验证

用初始流动相将氨鲁米特工作溶液稀释成质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40ng/mL的系列标准样品，甲喹酮内标浓度均为5ng/mL，然后按照上述优化后的前处理步骤进行处理并进行UHPLC-MS/MS测定，每种浓度做三次平行实验，取平均值。得出的数据以氨鲁米特与内标甲喹酮的进样浓度比x为横坐标，氨鲁米特与甲喹酮定量离子的积分面积比y进行线性拟合，求得线性回归方程为y=0.03345x-0.00271，r=0.9994，线性范围是0.1 ~50ng/mL，证明氨鲁米特的标准曲线线性关系良好。检出限（LOD）和定量限（LOQ）采用向空白尿样中逐级降低加标浓度的方法来确定，分别以3倍和10倍信噪比（S/N）对应的目标物浓度作为LOD和LOQ，分别为0.05ng/mL和0.1ng/mL。

选择日内和日间精密度来衡量方法的精密度，用相对标准偏差（RSD）来表示，测试选用5ng/mL氨鲁米特进行，测得结果日内精密度RSD为2.1，日间精密度RSD为4.3，证明该方法精确度良好。为了评估方法的重复性，六个平行加标浓度为5ng/mL的尿液经过上述优化后的前处理，用UHPLC-MS/MS法测得RSD为5.8，证明该方法的重复性良好。

为考察前处理过程的萃取效率，配制低（1ng/mL）、中（5ng/mL）、高（10ng/mL）三种浓度的加标尿样，进行优化后的UA-DLLME-UHPLC-MS/MS法测得数据，每种浓度做六次平行实验。结果表明，氨鲁米特的回收率在81.4% ~ 113.2%，RSD < 5.6%，证明该前处理方法可以有效提取马尿中的氨鲁米特。

为考察方法的选择性，配制20份空白尿样，按照优化后的前处理方法上样测定，未发现假阳性结果，证明该方法的选择性良好。

2.7 基质效应评估

由于尿液基质复杂，会影响测定结果的精密度和准确度。为考察基质的检测结果，本实验采用标准曲线法计算基质效应，公式为：

基质效应（ME）=（SA-SB）/SB×100%

式中：SA是指基质溶液加标物的标准曲线斜率，SB是指超纯水溶液加标物的标准曲线斜率。

结果算得基质效应为-4.9%，|ME|小于20%，表现出弱基质效应，基本可忽略不计。可见采用分散液液微萃取前处理方法，可以有效改善马术兴奋剂检测中基质效应的干扰。

2.8 方法比较

与其他测定尿样中氨鲁米特的检测方法（文献5、文献6）相比，UA-UPLC-MS/MS方法具有明显的优势：萃取时间短、线性范围宽、检出限低，能满足马术运动兴奋剂检测要求中的快速、灵敏度高。

3 结束语

本研究利用检测中心现有的仪器设备，建立了超声辅助分散液液微萃取/超高效液相色谱-串联质谱方法测定FEI禁用物质氨鲁米特的定量方法并进行了方法验证。与传统溶剂提取方法相比，整个实验过程无须酶解，减少了有机溶剂的用量，缩短了检测周期，降低了检测成本。实验结果表明，本方法灵敏度高，重现性好，无基质效应干扰，完全满足马术运动兴奋剂检测的要求。