非编码RNA 对肺癌中铁死亡调控作用的研究进展

杜林，陈峰，徐医军 综述，张逊 审校

（天津市胸科医院胸外科，天津 300222）

非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）是所有不被翻译成蛋白质的功能性RNA 的统称，按照核苷酸大小分类分为小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）和环状RNA（circRNA）[1-3]。ncRNA 可通过调控mRNA 来影响相关靶基因的表达，各种ncRNA 之间也存在相互作用。在2012 年，研究人员意外发现了一种依赖Fe2+催化作用的细胞程序性死亡方式，将其命名为细胞铁死亡[4]。铁死亡的生物学特征主要表现为线粒体萎缩、膜密度增加、线粒体嵴减少以及活性氧簇（ROS）聚集等[5]。铁死亡的发生机制包括：（1）Fe2+的代谢：转铁蛋白受体（transferring receptor，TFR）介导Fe2+的转运，铁蛋白的两条肽链重链和轻链可以调控Fe2+的储存。（2）脂代谢异常和ROS 的积累：脂氧合酶（LOX）催化不饱和脂肪酸的过氧化并影响铁死亡，核因子e2 相关因子2-kelch 样ECH 关联蛋白1（NRF2-KEAP1）系统调节细胞内稳态，抵抗外源性和内源性的氧化损伤，调节机体抗氧化蛋白的表达。（3）谷胱甘肽（GSH）的抗氧化作用：铁蛋白和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）调控GSH 的合成，GSH是一种铁死亡的抑制剂，能通过清除细胞自由基抑制铁死亡，而其合成异常也可导致铁死亡。近期研究表明，铁死亡在肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤的发生、发展及转移过程中起重要作用，成为近年来研究的热点。因此本文对近期ncRNA 调控肺癌中细胞铁死亡的相关研究进展进行介绍，为肺癌铁死亡相关研究提供参考。

1 lncRNA 通过影响脂代谢和ROS 积累，调节细胞铁死亡

由于外界因素诱导，细胞内稳态被扰乱，脂质相关基因表达异常，导致细胞内脂质氧化物大量积累，随即引发细胞铁死亡[6-7]。因此，对脂质氧化代谢的调控是影响铁死亡的重要机制。Sato 等[8]采用肺癌PC9、A549 和H358 细胞系，对lncRNA LINC00336 调控细胞铁死亡的机制进行了研究，发现LINC00336定位于细胞核内，过表达LSH 基因可诱导LINC00336转录水平的上调，无论是在肺腺癌细胞系还是在肺鳞癌细胞系中都有高表达。进一步研究发现，ELAV样RNA 结合蛋白1（ELAV-like RNA-binding protein 1，ELAVL1）是LINC00336 的上游调控因子，LSH 可通过抑制p53 的活性来诱导ELAVL1 的表达，进而ELAVL1 通过稳定其转录水平来上调LINC00336的表达。随后，通过RNA 结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）和RNA 蛋白拉拽沉淀证实了LINC00336 通过内源竞争RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）的吸附作用来抑制miR-6852 的活性，而miR-6852 的靶蛋白即是CBS，其同样可发挥ceRNA 的作用来抑制CBS mRNA 的转录。因此，LINC00336 对CBS 有上调作用，最终抑制肿瘤细胞铁死亡，促进肿瘤的形成与发展。该研究完整地呈现了LSH/p53/ELAVL1/LINC00336/miR-6852/CBS 轴的分子调控机制。另外，Chao 等[9]研究了lncRNA MT1DP 调节细胞铁死亡的分子机制，发现MT1DP 可通过抑制miR-365a-3p 的表达，进而抑制细胞的抗氧化反应，最终导致细胞的氧化应激反应的激活与加重。MiR-365a-3p 的异常表达可显著下调NRF2 的表达水平，从而调节erastin 介导的肺癌细胞铁死亡。这项研究最终证实了可通过MT1DP/miR-365a-3p/NRF2 轴来调控erastin 介导的肺癌细胞铁死亡，这两项研究成果为后续研究lncRNA 调控铁死亡的分子机制提供了理想范例。

2 miRNA 通过影响GPX4 的表达调控肺癌细胞 铁死亡

胱氨酸可在胱氨酸谷氨酸转运受体（System Xc-）的作用下还原为半胱氨酸，而后者是GSH 合成的原料之一[10]。GSH 可在GPX4 的催化作用下由还原型转变为氧化型，同时对细胞内的过氧化物进行还原，以抑制细胞铁死亡[11]。因此System Xc-、GSH、GPX4 构成了细胞内重要的抗氧化体系，同时也是细胞铁死亡的重要负调控因子。许多正负调控铁死亡的相关因子都是通过调控这个重要的抗氧化体系来发挥作用的。

研究发现，miR-324-3p 是二甲双胍诱导乳腺癌发生细胞铁死亡的靶点，说明miR-324-3p 不仅是铁死亡的诱导因素，而且参与了二甲双胍抗乳腺癌的作用机制[12]。Huang 等[13]以A549/DDP 肺癌细胞系为研究对象，结果表明，过表达miR-324-3p 的细胞中GPX4 表达水平显著降低，而荧光素酶标记的结果也表明，GPX4 是miR-324-3p 的直接靶点。该研究揭示了A549/DDP 细胞中miR-324-3p/GPX4信号轴的作用，且该信号轴也可能是逆转非小细胞肺癌顺铂耐药的潜在靶点。

miR-338 是另一种可靶向调控GPX4 的miRNA，在肝癌、胃癌、肺癌等肿瘤组织中的表达量与正常组织相比均显著降低[14-15]。Chen 等[16]和Tarangelo等[17]采用PCR 对肺癌组织、癌旁组织、肺癌细胞系和正常肺部细胞系的miR-338 和GPX4 mRNA 水平进行检测，并采用双荧光素酶法验证miR-338 和GPX4 的关系，结果表明，与癌旁组织、正常细胞相比，肺癌组织以及肺癌细胞系中miR-338 表达水平均显著降低，双荧光素酶也证实miR-338 和GPX4的直接作用。此外，对miR-338 进行过表达处理，可以明显提高肿瘤细胞系ROS 水平，并有效抑制肿瘤细胞生长和迁移，而加入细胞铁死亡抑制剂，可以削弱甚至逆转miR-338 的抑制肿瘤细胞生长和迁移作用。最终证实miR-338 可通过负调控GPX4 的表达进而促进肿瘤细胞铁死亡，从而抑制肿瘤细胞的生长和迁移。

3 lncRNA 通过调控p53 的表达促进肺癌细胞铁死亡

众所周知，p53 介导的细胞衰老和细胞凋亡是抑制肿瘤生长、迁移的关键。但除此之外，p53 还可以通过调节RNA 转录或蛋白质翻译来诱导细胞铁死亡的发生[18-19]。一方面，p53 通过抑制溶质载体家族7 成员11 的表达，或通过提高亚精胺/精胺n1-乙酰转移酶和谷氨酰胺酶2 两种重要蛋白的表达来增强细胞铁死亡；另一方面，p53 可通过直接抑制二肽基肽酶4 的蛋白活性来抑制erastin 所诱导的细胞铁死亡的发生，还可通过诱导cyclin 依赖激酶抑制因子表达、减缓细胞内GSH 的消耗和减少ROS 积累来抑制细胞铁死亡。由此可见，p53 对细胞铁死亡的调控具有明显的生物双向性，这与细胞系、细胞环境息息相关。因此p53 上下游相关通路的调控对铁死亡的影响是十分复杂的。Song 等[20]和Kenneth 等[21]对比了A549 等7 种肺癌细胞系和MRC-5 等2 种正常肺部细胞系的细胞质中lncRNA p53RRA 的表达水平，结果表明，在肿瘤细胞中，p53RRA 表达水平显著下调。证明p53RRA 可以直接作用于靶蛋白功能域，从而调控p53 的表达和移位，促进细胞铁死亡，抑制肿瘤的进展。

4 ncRNA 调控肺癌铁死亡的其他机制

Lu 等[22]采用A549 肺癌细胞系进行顺铂耐药诱导实验，研究敲降或过表达miR-4443 对细胞铁死亡的影响。实验结果表明，过表达miR-4443 可以通过与铁死亡抑制蛋白1（FSP1）相互作用，进而抑制顺铂介导的细胞铁死亡，并促进肺部肿瘤的体内生长。另一项研究发现，lncRNA NEAT1 在肺癌细胞铁死亡中具有重要调节作用[23]。酰基辅酶A 合成酶长链家族成员4（ACSL4）是一种重要的脂肪酸激活酶，可通过调节细胞脂质组合来影响细胞铁死亡的敏感性，是一种经典的细胞铁死亡抑制因子。通过生物信息学分析发现，NEAT1 和ACSL4 具有直接结合的分子靶区，表明NEAT1 与ACSL4 的靶向结合可以抑制ACSL4 的正常表达，导致肺癌细胞对细胞铁死亡的敏感性。同时，NEAT1 增强了肺癌细胞对erastin 诱导细胞铁死亡的敏感性，最终导致肺癌细胞的铁死亡。

5 肺癌细胞铁死亡ncRNA 的潜在调控靶点

5.1 参与肺癌细胞中铁离子的转运调控 细胞铁死亡离不开铁离子的介导。TFR1 可以与其配体结合并内化，以维持细胞内铁离子的稳定[24]。TFR1 受多种ncRNA 调控，其水平下调可激活细胞铁死亡通路[25-26]。lncRNA PVT1 在肺癌细胞中有表达，且其对肺癌细胞增值的促进作用也已被证实[27]。PVT1 的下游靶向miR-214-3p 也可通过下调TFR1，从而对细胞铁死亡有调节作用。但PVT1/miR-214-3p 轴对肺癌中铁死亡的作用尚未见报道。

5.2 肺癌铁死亡调控相关ncRNA 的生物信息学分析 Kirill 等[28]对TCGA 数据库中的肺腺癌转录组数据进行分析，发现9 个与铁死亡预后相关的lncRNA，均可独立地用来预测肺腺癌患者的预后，并可能成为新的治疗靶点。Wu 等[29]则对非小细胞肺癌的临床样本基因表达谱进行生物信息学分析，最终确定了10 个既与非小细胞肺癌预后相关，又与细胞铁死亡相关的lncRNA，然后选取其中9 个lncRNA 分子用于构建非小细胞肺癌预后模型，并将非小细胞肺癌患者分为高风险和低风险两组。结果显示，高风险组患者的预后更差。上述研究为临床探索相应的治疗靶点与生物标志物提供了新颖而有益的科研思路。但是，关于ncRNA 调控肺癌中细胞铁死亡机制的研究仍在起步阶段，现有的文献报道尚未完全揭示肺癌中铁死亡的发生、发展与调控可靠的机制。首先，各项研究都是以肺癌细胞系样本（如A549、H358 等）为主[30]，并未对临床样本进行大规模、系统化的深入研究与探讨。其次，只有少部分研究探寻了某个lncRNA/miRNA 轴对下游因子以及铁死亡相关因子的调控作用，很多研究都只停留在某个lncRNA 或miRNA 的单一作用上，也未研究其上游有哪些调控因子可以影响其表达，也并未对ncRNA 调控系统进行全面分析。第三，circRNA 对肿瘤中铁死亡的影响已于其他肿瘤报道[31]，但是在肺癌领域仍未发现circRNA 对细胞铁死亡的调控作用。第四，细胞铁死亡有其特殊的细胞形态学特征，如线粒体嵴减少、细胞膜破裂等，但有某些关于细胞铁死亡的研究并未给出明确的细胞电镜结果，而现在的学术界普遍认为电镜结果是证明细胞发生铁死亡的金标准[32]。第五，细胞铁死亡与药物耐药之间的研究仅停留在顺铂等1～2 种药物上[33]，对于靶向药、免疫检查点抑制剂的耐药，铁死亡抵抗究竟是否参与其中尚不得知。相信随着研究的不断深入，一定能揭示出更多关于铁死亡与肿瘤之间的奥秘，为对抗肿瘤提供更为有利的医学武器。