hnRNP U在恶性肿瘤中的研究进展

李梦园，孔令非

（郑州大学人民医院a.肿瘤内科；b.病理科，河南 郑州 450003）

选择性剪接是真核基因中普遍存在的转录后过程，也是少量基因产生大量mRNA并加工成结构、功能不同的蛋白质亚型的重要机制［1］。在癌细胞中，正常的选择性剪接调节受到干扰，导致癌症特异性RNA转录增强，促使癌细胞增殖、迁移、死亡逃避和凋亡［2-3］。近期多项有关实体瘤的研究表明，癌症特异性剪接模式归因于异常调节的剪接因子［4］。这使干扰癌症发展的剪接因子备受关注［5-6］。核不均一性核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）家族是关键的选择性剪接调节因子，已鉴定出包括hnRNP A～U在内的约20个关键成员，它们可以通过RNA结合域（RNA binding domains，RBDs）识别特定RNA序列，使pre-mRNA成熟为稳定的功能性mRNA［7-8］，从而参与肿瘤的代谢等生物学过程。该家族蛋白表达紊乱可导致靶凋亡基因功能受损，使细胞异常增殖，增强细胞耐药性［9］。hnRNP U在该过程中表达明显异常［10］，提示了hnRNP U在肿瘤诊断和治疗方面的潜在价值。

1 hnRNP U的结构和功能

hnRNP U位于1号染色体q44，是hnRNPs家族中分子量最大的磷酸化蛋白质，由825个氨基酸残基组成，分子量为90.584 kD。其C端存在富含甘氨酸的RNA结合域，并含有一段重复的RGG序列，称为RGG box［11］。hnRNP U也被称为SAF-A，其蛋白中包含骨架/基质相关区（S/MAR）特异性双向DNA结合域，可以选择性地结合DNA核骨架附着区。hnRNP U通常与RNA、DNA和蛋白质形成复合物，以复合物的形式参与细胞功能的调节过程。hnRNPU可与RNA结合，通过增强RNA的稳定性来促进mRNA的表达，或与mRNA直接结合后参与mRNA的形成过程［12］。随着对分子研究的进一步深入，hnRNP与mRNA的特异性结合位点也被逐渐发现。

hnRNP U在哺乳动物的多种生理过程中发挥了关键作用。Xist基因是哺乳动物X染色体失活起始过程中的关键基因，hnRNP U的RGG box能特异性识别Xist RNA，这种特异性识别维持了X染色体中Xist RNA的累积，这对X染色体的失活是必须的［13］。这表明hnRNP U是Xist RNA调节基因表达、参与X染色体失活的重要因子。hnRNP U 不仅具备一般hnRNPs蛋白的功能，还能与DNA及蛋白质分子特异性结合，通过独特的作用模式发挥各种生物学功能。其与S/MAR DNA的特异性结合，参与DNA在核骨架中的定位和停泊过程［14］，与随体DNA（satDNA）结合，参与了染色质的三维空间结构的形成过程［15-16］。在蛋白水平上，hnRNP U与蛋白结合调控转录过程，并与RNA聚合酶Ⅱ的高磷酸化C端重复结构域结合，影响初始转录物或DNA模板的形成［17-19］。除此之外，hnRNP U还与有丝分裂、DNA损伤及凋亡过程有联系，可能是潜在的Wilms肿瘤相关基因［20］。

hnRNP U在多种肿瘤组织中表达水平升高，通过调控肿瘤相关基因稳定其结构或发生异常选择性剪接产生致癌性的剪接体，影响细胞的增殖、凋亡、肿瘤相关免疫反应及上皮-间质转换等生物学过程，促进了肿瘤的发生和发展。目前已有较多hnRNP U相关研究在不同恶性肿瘤中出现。

2 hnRNP U在恶性肿瘤中的研究进展

2.1 hnRNP U与肺癌 肺癌被认为是最常见的癌症类型和肿瘤相关死亡的主要原因。近年来，尽管肺癌治疗的诊断和治疗方式均有了显著改善，但当疾病扩散到区域淋巴管时，预后仍然很差［21］。在这种情况下，鉴定涉及肺癌转移的基因和分子途径开辟了肺癌治疗进展的可能性。hnRNP U在存在真底物蛋白（p-β-连环蛋白等）的情况下与β-TrCP复合物分离，两者分离之后β-TrCP复合物与p-β-catenin结合，导致p-β-catenin通过泛素-蛋白酶体途径降解，细胞迁移从而受到抑制［22-23］。这一结论在后续的细胞迁移研究中应用广泛。Tseng等［24］发现生长停滞特异性蛋白7（growth arrest specific protein 7，GAS 7）在肺癌患者中低表达，且在肺癌细胞的迁移中发挥抑制作用，这一作用通过GAS 7C/hnRNP U和GAS 7C/N-wasp的同时存在来达成。体内实验中，经尾静脉注射过表达GAS 7C细胞的裸鼠肺表面肿瘤结节数量明显少于注射载体对照细胞组的裸鼠，体外细胞迁移实验也证实了这个结论［24］。在人类GAS 7亚型中，只有GAS 7C具有Src同源结构域3，GAS 7C的过度表达可隔离hnRNP U，通过β-TrCP泛素降解途径降低了p-β-catenin蛋白的水平，由此减弱了肺癌细胞的迁移作用。因此，hnRNP U在GAS 7C抑制肺癌细胞迁移的过程中起到关键作用。

非小细胞肺癌是肺癌中占比高且预后不良的分型。Pan等［25］通过pulldown实验证明了hnRNP U和LIMD1 mRNA在LIMD1-AS1下拉的产物中富集。虽然LIMD1-AS1在非小细胞肺癌中低表达，但是其阻碍非小细胞肺癌细胞的增殖并促使其凋亡的机制并不清楚。但有研究证实hnRNP U的敲除降低了肺癌细胞A549中LIMD1 mRNA和蛋白质的水平，同时缩短了LIMD1 mRNA的半衰期［25］。这表明hnRNP U通过与LIMD1-AS1相互作用来维持LIMD1 mRNA的表达及稳定，从而抑制了非小细胞肺癌的进展。这可能有助于为非小细胞肺癌的分子靶向治疗提供新的思路。

2.2 hnRNP U与肝癌 肝癌是常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的第三大原因。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占所有原发性肝肿瘤的75%～85%，尽管HCC的诊断和治疗有所改善，但由于其侵袭性和高增殖能力，HCC的预后仍然很差［26］。导致肝癌发生发展的因素很多，表观遗传学是肝癌发生发展研究的新热点。Zhang等［27］发现hnRNP U在晚期肝癌组织及肝癌细胞内的表达明显上调，这种上调与HCC患者的临床分期及不良预后相关。通过克隆形成、使用CCK8试剂测定细胞存活数等增殖实验证明了在体外肝癌细胞系中敲除hnRNPU后，肝癌细胞的增殖活力、耐药性以及对化疗诱导凋亡的抵抗性均明显下降［27］。小鼠的异种移植实验也证实了在体内敲除hnRNP U对肝癌细胞的增殖有抑制作用［27］。c-Myc基因是最常见的原癌基因，具有可使细胞无限增殖获得永生化的功能，在细胞的分化、凋亡和调控中起着重要的作用［28］。临床HCC患者样本中，c-Myc与hnRNP U在mRNA水平上呈正相关。hnRNP U的启动子区域-增强子盒序列（E-box）存在c-Myc结合位点，且c-Myc与癌症中的剪接体及异常剪接事件有关［29-30］。在机制方面，研究［28］验证了上述结论，证明了hnRNP U启动子区域可与c-Myc结合，稳定了c-Myc mRNA并参与调节c-Myc蛋白表达的过程，同时验证了c-Myc在调节hnRNP U转录方面发挥了积极作用。综上所述，hnRNP U和c-Myc的这种正反馈环路可能导致了HCC的进展及不良预后，hnRNPU可能作为HCC一种新的诊断和治疗靶点。

Liang等［31］发现hnRNPU在HCC中表达上调，且hnRNP U的上调与HCC患者预后不良相关。敲低hnRNP U后，HCC细胞的增殖在体内外均受到抑制。机理上，通过染色质免疫共沉淀、双荧光素酶报告、实时荧光定量聚合酶链式反应等实验证明了hnRNP U与细胞周期调控的关键因子CDK2基因位点结合，其中H3K27乙酰化（acetylation of lysine 27 on histone H3，H3K27ac）、H3K9乙酰化（acetylation of lysine 9 on histone H3，H3K9ac）和H3K4单甲基化富集。此外，敲低hnRNP U降低了结合位点的H3K27ac和H3K9ac水平，H3K27三甲基化水平增加，最终导致CDK2下调。这项研究结果提出了一种新的机制，即hnRNP U通过增强CDK2的转录促进HCC的发展。

2.3 hnRNP U与胰腺癌 胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是世界范围内人类恶性肿瘤中最致命的癌种之一，多数患者在诊断时即发现处于疾病晚期或已经发生了远处转移。PDAC的5 a总生存率低于6%，即使是最先进的化疗也只能提供有限的生存益处［21，32］。因此，迫切需要开发针对这种疾病的创新靶向分子疗法，以提高PDAC的治疗效果。蛋白编码基因的突变无疑启动和促进了PDAC的发生，然而非编码RNA也发挥了一定的作用。Sutaria等［33］发现了一种由hnRNP U加工转录的lncRNA（C1orf199/ncRNA00201），与正常和良性标本相比，胰腺癌细胞系中hnRNP U处理的转录本表达量显著增加。细胞划痕实验及Boyden小室侵袭实验证明敲除hnRNP U的转录本后可减少胰腺癌细胞系的增殖、迁移和侵袭［33］。同时，该研究发现hnRNP U的敲除可导致胰腺癌细胞中hnRNP U的转录本ncRNA00201表达量明显减少［33］。这表明hnRNP U作为一种RNA结合蛋白，可以直接或间接调节其加工转录本的表达。hnRNP U作为RNA结合蛋白与hnRNP U的转录本相互作用，阻止其处理的转录本在细胞中降解［34-35］。另一项研究对临床PDAC患者样本进行分析发现，与预后良好的患者相比，预后不良的PDAC患者标本中hnRNP U处理的转录本lncRNA表达量增加，说明hnRNP U处理的转录本与患者的预后不良相关［36］。综上可知，hnRNP U及其处理的转录本促进了胰腺癌的进展并可作为预后预测分子，有利于胰腺癌的诊断和治疗。

2.4 hnRNP U与黑色素瘤 黑色素瘤是由皮肤中黑素细胞产生的恶性肿瘤，其特征是高度侵袭和远端器官转移。黑色素瘤的早期侵袭和转移扩散倾向导致患者总体生存率较低，占所有皮肤癌相关死亡的79%。黑色素瘤的发病率逐年上升，转移的患者生存期仅6～9个月，5 a生存率不及5%［37］。研究肿瘤发病和侵袭转移机制对改善肿瘤患者的预后至关重要。在黑色素瘤中，Mazur等［38］证明了hnRNP U是胶溶蛋白Gelsolin的分子伴侣。胶溶蛋白是一种多功能肌动蛋白结合蛋白，存在于细胞入侵足的前缘或细胞核中，主要负责肿瘤细胞的迁移，其高表达与黑色素瘤的不良预后相关［39-40］。使用来自黑色素瘤细胞的全细胞裂解物和核组分裂解物的复合物通过液相色谱/质谱分析及免疫共沉淀的方法，鉴定出与内源性胶溶蛋白相互作用的新蛋白伙伴hnRNP U。hnRNP U与胶溶蛋白的抗体共同对A357和WM9两种黑色素瘤细胞进行染色后，使用激光共聚焦显微镜观察，可发现在细胞的有丝分裂期间hnRNP U与胶溶蛋白的共定位现象。这进一步证实了hnRNP U与胶溶蛋白之间存在直接的相互作用。以上内容揭示了hnRNP U与胶溶蛋白互为分子伴侣，其与胶溶蛋白共同参与了黑色素瘤的进展过程。

2.5 hnRNP U与神经母细胞瘤 神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体肿瘤，占儿童癌症死亡原因的15%。对于高危病例，尽管进行多模式治疗，患者的生存率仍然很低。在神经母细胞瘤中，致癌基因的激活或抑癌基因的失活有助于肿瘤细胞中糖酵解基因的表达，因此研究有氧糖酵解的调控因子对提高神经母细胞瘤的治疗效率具有重要意义。Song等［41］发现与正常背根神经节相比，42个原发神经母细胞瘤组织中，hnRNP U、CCCTC-结合因子（CCCTC-binding factor，CTCF）、HNF4A、CXCR4或TPBG表达较高，CLU或UACA水平较低且肿瘤组织或血清中HNF4A-as1水平高的患者生存率较低。HNF4A-AS1、hnRNPU和CTCF的表达与42例神经母细胞瘤患者的生存显著相关［42］。CTCF是广泛存在于真核生物中的多功能转录因子，与细胞的生长、增殖及肿瘤的发生相关。该研究使用生物素标记RNA下拉和质谱分析、RNA免疫沉淀法、免疫共沉淀及双分子荧光互补等体外实验证明了lncRNA HNF4A-AS1可与hnRNP U的RGG结构域结合，促进了由hnRNPU介导的CTCF的反式激活，进而调控了神经母细胞瘤细胞的有氧糖酵解过程，增强了肿瘤细胞的侵袭性［41］。CTCF与某些因子的结合可以造成致癌转录［42］，而hnRNP U作为特异性因子与CTCF发生相互作用激活CTCF，从而继发转录失调导致癌症的发生。由此可知，hnRNP U与CTCF的结合导致了lncRNA HNF4A-AS1及其他与肿瘤进展相关的基因发生转录改变。通过lncRNA HNF4A-AS1反过来促进了CTCF与hnRNP U的结合。这表明HNF4A-AS1/hnRNP U/CTCF轴在神经母细胞瘤的进展中起到关键作用。

3 小结与展望

近年来，随着研究方法的进步，人们逐渐认识到在转录水平上，选择性剪切因子在表观遗传及肿瘤发生发展过程中的重要作用，剪切因子也成为了近年肿瘤学的研究热点。目前已经有许多剪接因子抑制剂的临床试验正在进行。hnRNP U作为选择性剪切因子，也是hnRNPs家族中的重要成员，被发现在多种恶性肿瘤中高表达，且与肿瘤的进展及患者的预后密切相关。这提示了hnRNP U作为恶性肿瘤标志物在治疗靶点的潜在价值及恶性肿瘤诊断和预后判断中的重要意义。对于hnRNP U介导的异常转录和异常选择性剪接已有较多研究，然而其与蛋白质分子结合发挥特定生物学功能的作用机制仍需进一步探索。