程序性细胞死亡蛋白 1 抑制剂抵抗在骨肉瘤治疗中的研究进展

赵欢欢 王玲 张国川

骨肉瘤 ( osteosarcoma，OS ) 是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤[1]。目前的主流治疗方案是：手术切除原发肿瘤联合新辅助化疗和辅助化疗。标准的治疗使局限性骨肉瘤患者的 5 年生存率提高到了 70%，但是对复发性或转移性骨肉瘤的治疗效果不理想[2]。在转移性骨肉瘤患者中，长期生存率低于 30%，转移病灶常常累及到肺脏，而这是造成大部分患者死亡的原因[3]。在过去的 30 年里，尽管进行了大量化疗和靶向治疗方案试验，骨肉瘤患者生存率一直没有得到进一步明显的改善。因此，有必要寻找新型治疗药物来改善骨肉瘤患者的临床疗效。

肿瘤细胞可以通过过度表达免疫抑制性检查点，与免疫细胞上相应受体结合，使得对应的免疫细胞功能降低甚至耗竭，从而实现免疫逃逸。免疫检查点抑制剂的出现及其应用，已经改善了多种肿瘤的预后[4-8]。然而，临床前研究表明，骨肉瘤对程序性细胞死亡蛋白 1 ( programmed cell death protein 1，PD-1 ) 抑制剂治疗不敏感[9]，存在抵抗现象。使用 PD-1 抑制剂的临床试验也表明，其对大多数骨肉瘤患者无明显效果或者出现耐药[10]。在一项有关派姆单抗治疗原发性骨肉瘤的 Ⅱ 期临床试验中，发现其缺乏疗效[11]。因此，研究如何克服 PD-1 抑制剂在骨肉瘤治疗中的抵抗效应，提高骨肉瘤组织对 PD-1 抑制剂的敏感性具有重要意义。

一、PD-1 概述

PD-1 ( CD279 )，于 1992 年首次被发现，位于人类 2 号染色体上。PD-1 由免疫球蛋白 ( Ig ) 超家族结构域、22 个氨基酸组成的茎干区、跨膜结构域和细胞内结构域组成，该细胞内结构域包含免疫受体酪氨酸抑制基序 ( immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM ) 和免疫受体酪氨酸转换基序 ( immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM )。当配体程序性细胞死亡蛋白配体 1 ( programmed cell death protein ligand 1，PD-L1 ) 与受体 PD-1 相互作用时，可诱导后者的 ITIM 和 ITSM 的磷酸化，随后将 PD-L1 相关的抑制性信号传递给各种信号蛋白，如 PI3K / AKT、STAT3 等，进而抑制 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、树突状细胞等的免疫活性，介导免疫逃逸[12-19]。

二、PD-1 抑制剂在骨肉瘤治疗中的抵抗耐药机制

1. 肿瘤免疫原性对 PD-1 抑制剂疗效的影响：有研究表明，肿瘤表面越是形成高免疫原性肿瘤特异性抗原，PD-1 抑制剂的疗效就会越好，如高免疫原性的黑色素瘤、非小细胞肺癌等肿瘤，对 PD-1 抑制剂的治疗比较敏感。但是如果肿瘤特异性抗原表达过低，免疫原性弱，抗原提呈细胞无法识别有效抗原，便无法活化 T 细胞，则会表现出对 PD-1 抑制剂的抵抗[20-24]。

骨肉瘤的基因组复杂，大多数骨肉瘤的特征是复杂的染色体异常，具有明显的细胞间异质性，而高度突变和重排的骨肉瘤基因组可能不能够产生足够的新抗原，从而导致其免疫原性有限[25]，对 PD-1 抑制剂的治疗不敏感。

2. CD38 表达对 PD-1 抑制剂抵抗的影响：已有报道称 CD38 的升高是 PD-1 / PD-L1 抑制剂获得性耐药的主要机制，其可以抑制 T 细胞的免疫功能[26]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 ( NAD+) 在维持 T 细胞功能方面起着重要作用，CD38 水平升高导致 NAD+浓度降低，从而降低 T 细胞活性[27]。同时，CD38 是腺苷在产生过程中一种重要的催化酶，而腺苷可通过下游的腺苷受体 2A 或 2B 信号级联途径抑制 CD8+T 细胞的活性，从而减弱对肿瘤细胞的杀伤能力[20]。抗 CD38 单克隆抗体和 PD-1 抑制剂的联合应用可提高抗肿瘤免疫应答，提示了 CD38 与出现 PD-1 抑制剂抵抗现象的相关性[28]。通过降低 CD38 的表达，可以提高 PD-1 抑制剂治疗的敏感性，为骨肉瘤提供了一个新的治疗理念。

Nasarre 等[26]在一项小鼠体内骨肉瘤的药物试验中，分泌卷曲相关蛋白 2 ( secreted frizzled-related protein 2，SFRP2 ) 单克隆抗体可以明显减少 CD38 在小鼠脾脏 T 细胞、肿瘤浸润淋巴细胞上的表达，进一步研究显示 SFRP2 通过促进活化 T 细胞核因子 3 ( nuclear factor of activated T cells 3，NFATC3 ) 来增加 CD38 和 PD-1 在 T 细胞上的表达，而使用 SFRP2 单克隆抗体可特异性下调 CD38 和 PD-1 的表达，从而克服骨肉瘤对 PD-1 抑制剂的药物抵抗性。PD-1 抑制剂联合 SFRP2 单克隆抗体治疗小鼠骨肉瘤，二者表现出协同促进作用，可抑制转移性骨肉瘤，且无毒性迹象。近年来，一些免疫检查点抑制剂与 CD38 单克隆抗体的组合已开始被应用[29]。

3. 肿瘤 PD-L1 表达水平与 PD-1 抑制剂抵抗的关系：对于大部分肿瘤，PD-L1 表达阳性的患者对 PD-1 / PD-L1 抑制剂治疗的临床反应更好[30-31]。如在黑色素瘤患者身上，PD-L1 在肿瘤细胞上的早期表达可以提高 PD-1 抗体的疗效。对于骨肉瘤来说，肿瘤细胞 PD-L1 表达水平的提高同样可以提高 PD-1 抑制剂免疫治疗的敏感性。

Mochizuki 等[32]介绍了一种使用端粒酶特异性溶瘤腺病毒来克服骨肉瘤中 PD-1 抑制剂治疗的抵抗效应。端粒酶特异性溶瘤腺病毒显著增加了 PD-L1 蛋白在小鼠 K7M2 和 NHOS 骨肉瘤细胞表面的表达。CD8+T 细胞与骨肉瘤细胞之间可以通过 PD-1 与 PD-L1 的结合来加强二者的联系，从而改善骨肉瘤对 PD-1 抑制剂的抵抗，而 PD-L1 表达的增加可以促进这种结合。

4. CD8+T 细胞耗竭与 PD-1 抑制剂抵抗的关系：PD-1 的表达在 T 细胞的功能失调中起着重要作用，其持续高表达往往提示存在着免疫功能的严重受损。随着肿瘤在体内存在时间的延长，生长速度的加快，PD-1 的表达会越高，导致失效的 T 细胞就会越多，特别是 CD8+T 细胞的失活，甚至严重耗竭，从而降低免疫敏感性，面对 PD-1 抑制剂而出现的抵抗效应就越严重[20,33]。对于轻度或者中度表达 PD-1 的 CD8+T 细胞，PD-1 抑制剂还可以使其重新恢复活力并发挥免疫功能，但 PD-1 抑制剂对 PD-1 高表达的失活 CD8+T 细胞则无明显的刺激作用[34-35]，依此可以判断肿瘤对 PD-1 抑制剂的抵抗程度。

使用端粒酶特异性溶瘤腺病毒，克服骨肉瘤中 PD-1 抑制剂治疗的抵抗效应，端粒酶特异性溶瘤腺病毒联合 PD-1 抑制剂，除了可以增加 PD-L1 蛋白的表达，还可明显增加肿瘤内 CD8+T 细胞的数量和恢复其活力并使其充分浸润到肿瘤组织内。提示端粒酶特异性溶瘤腺病毒治疗具有诱导产生肿瘤浸润 CD8+T 细胞的作用，从而增强骨肉瘤对 PD-1 抑制剂治疗的敏感性，促进抗肿瘤免疫应答。

5. 髓系来源抑制性细胞 ( MDSCs ) 与 PD-1 抑制剂抵抗的关系：MDSCs 可以表达 VEGF、bFGF 等促血管生成因子，其可以直接促进肿瘤血管的形成，另外，MDSCs 还通过释放活性氧去除 T 细胞增殖所需的关键营养物质，从而抑制 T 细胞功能[36]，抑制细胞毒性 T 淋巴细胞 ( cytotoxic T lymphocyte，CTL ) 进入肿瘤组织，所以在 MDSCs 存在时，即使 CTL 被 PD-1 抑制剂激活，但由于肿瘤组织中 CTL 的浸润不足，影响 PD-1 抑制剂作用的发挥，出现抵抗现象。

Horlad 等[37]在小鼠骨肉瘤模型的肿瘤组织中发现大量 MDSCs，MDSCs 在骨肉瘤进展和转移中发挥重要的作用。Jiang 等[38]发现趋化因子受体 4 ( chemokine receptor 4， CXCR4 ) 拮抗剂可以减少小鼠骨肉瘤组织内表达 CXCR4 的 MDSCs，而 MDSCs 的抑制可以恢复 T 细胞介导的特异性抗肿瘤免疫以及 NK 细胞和巨噬细胞介导的天然抗肿瘤免疫，并且 CXCR4 拮抗剂与 PD-1 抑制剂共同应用时具有协同作用，可显著提高抗肿瘤作用，延长小鼠生存期。进一步研究发现 CXCR4 拮抗剂与 PD-1 抑制剂的联合应用可以促进 CTL 在骨肉瘤组织内浸润并控制肿瘤生长。提示 CXCR4 拮抗剂通过抑制 MDSCs 并增加肿瘤组织中 CTL 的浸润，克服 PD-1 抑制剂在骨肉瘤治疗中的抵抗。

6. PI3K-AKT 信号通路与 PD-1 抑制剂抵抗的关系：PI3K 磷脂酰肌醇-3-激酶，AKT 又称作蛋白激酶 B ( PKB )， 是 PI3K 重要的下游分子，组成 PI3K / AKT 信号通路，其是调节蛋白质合成的主要信号通路，促进细胞周期的进展，包括细胞增殖、分化、凋亡等。同时，又与肿瘤的发生发展密切相关，因此也受到许多因子的负调控，以避免其过度激活[20]。肿瘤细胞 PD-L1 的表达受到 PI3K / AKT 信号通路的调控，并且有试验研究显示，选择性地抑制 PI3K 可增强相关肿瘤对 PD-1 / PD-L1 抑制剂的敏感性。

Shi 等[39]报道了一项关于 PI3K 特异性抑制剂 SNA 促进骨肉瘤对 PD-1 抑制剂敏感性的研究。试验中对荷瘤小鼠联合使用 SNA 和 PD-1 抑制剂治疗，结果显示，与单独药物治疗相比明显减缓了肿瘤的生长，并显著延长了小鼠生存时间。进一步研究发现，SNA 通过抑制下游 AKT 和 S6 的磷酸化来抑制 MDSCs 的活性，并且促进 CD8+T 细胞对肿瘤组织的浸润，提高了 PD-L1 在肿瘤细胞上的表达，促使肿瘤组织内肿瘤相关巨噬细胞 M1 型转变，从而激活了肿瘤微环境，增强了 T 淋巴细胞的免疫效能，提高 PD-1 抑制剂的抗骨肉瘤免疫能力。

PD-1、PD-L1 在骨肉瘤组织中表达增高，并且与患者的预后密切相关[40-45]，PD-1 抑制剂在骨肉瘤免疫治疗当中本应起到重要作用，但是其效果并不太尽如人意。本文通过对 PD-1 抑制剂在骨肉瘤治疗中的抵抗机制进行总结分析，发现其受到了免疫原性、免疫因子、免疫抑制细胞、肿瘤信号通路、肿瘤微环境等多方面的影响。今后还须深入地研究，分析各方面的因素，以期获得解决 PD-1 抑制剂抵抗性的最佳方案，以给骨肉瘤患者带来更大的益处。