间充质干细胞调控细胞自噬的作用及机制

刘红红 徐积兄

(南昌大学第一附属医院，江西 南昌 330006)

间充质干细胞(MSCs)是一种多能基质细胞，可以分化为多种细胞类型，包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞〔1〕，具有抗自身免疫、分泌多种细胞因子和生长因子的功能〔2～4〕。MSCs 在治疗许多疾病上都具有比较好的疗效，如糖尿病并发症、肝硬化、系统性红斑狼疮(SLE)等疾病，但具体作用机制尚不完全明确。自噬是细胞程序性死亡的一种类型，即“Ⅱ型程序性细胞死亡”，是通过与溶酶体融合来消化细胞自身细胞器、蛋白质的一种降解过程。自噬是调节细胞发育、分化、存活和内稳态的重要途径〔5〕。鉴于MSCs的治疗作用，目前关于MSCs在调控宿主细胞自噬方面的作用及机制也越来越受关注，本文就MSCs及其外泌体、条件培养基调控不同宿主细胞自噬的作用及机制进行综述。

1 MSCs与细胞自噬

自噬是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。在自噬过程中，自噬小体吞噬细胞质成分，导致胞浆形式的微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3-Ⅰ)结合形成LC3-磷脂酰乙醇胺复合物(LC3-Ⅱ)。因此，LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比率代表自噬活性〔6～8〕。自噬相关蛋白(ATG)6和Beclin-1是最重要的自噬调节因子，Beclin-1的上调通常代表自噬活性的增加〔9〕。在正常生理条件下，自噬在低水平持续进行，清除多余和受损的细胞内物质。这使细胞能够重复利用降解的核苷酸、氨基酸和脂肪酸，以维持细胞的正常结构和功能〔10〕。然而，在应激条件下，自噬诱导营养物再生或细胞死亡〔11，12〕。因此，自噬可以影响细胞的生长状态，调节细胞增殖或诱导细胞死亡。自噬也在生理和病理过程中起着重要作用〔13〕。已有研究表明，自噬不足导致蛋白质聚集物的积累，导致包括中枢神经系统、肝脏和肾脏在内的各种器官的组织损伤〔14～16〕。雷帕霉素机械靶蛋白(mTOR)是自噬的关键调节剂，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)-结节性硬化复合物(TSC)通路是mTOR的上游信号通路。PI3K-Akt途径被认为是调节自噬的主要途径之一〔17〕。

MSCs具有很强的自我更新能力和分化潜能，广泛应用于再生医学。目前应用较多的MSCs主要有：骨髓(BM)-MSCs、脂肪(AD)-MSCs、脐带(UC)-MSCs、胎盘(P)-MSCs。目前关于MSCs在调控细胞自噬的治疗作用的研究越来越多。MSCs可以增强细胞的自噬能力以抵抗凋亡〔18〕。在BM-MSCs与露于高糖(HG)培养基的大鼠胰岛素(INS)-1细胞共培养的一项研究中发现：BM-MSCs可使细胞Beclin-1和LC3-Ⅱ表达增强，自噬小体和自噬溶酶体的形成增加，细胞凋亡减少〔19〕。MSCs可分泌外泌体，外泌体可与受体细胞的细胞膜融合，并将蛋白质和RNA运送到细胞中，从而影响细胞功能。研究表明，移植的干细胞主要通过旁分泌机制发挥治疗作用，而外泌体在这一过程中起着重要的作用〔20〕。Liu等〔21〕发现MSCs来源的外泌体(MSC-Exo)可通过AMPK/mTOR和Akt/mTOR途径诱导心肌细胞自噬，从而降低心肌缺血再灌注(I/R)损伤。

据报道，干细胞在培养液中分泌的神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子和脑源性神经营养因子等细胞因子可促进细胞生长〔22～24〕。因此，MSCs条件培养基(MSCs-CM)也可以影响细胞活性及功能。研究发现ucMSCs-CM通过调节小胶质细胞的自噬和增强β-淀粉样蛋白(Aβ)降解酶的表达，保护小胶质细胞免受Aβ25-35诱导细胞死亡，促进Aβ吞噬〔25〕。

2 MSCs对细胞自噬的调节作用

MSCs可通过不同通路调节β细胞、肝细胞、胆管上皮细胞、神经细胞、软骨细胞、肺内皮细胞及T细胞的自噬水平，从而发挥对疾病的治疗作用。

2.1胰岛β细胞 2型糖尿病(T2DM)是人类最常见的慢性代谢性疾病，其特征是胰腺β细胞衰竭引起的HG和胰岛素分泌不足以补偿胰岛素抵抗。而慢性HG又是β细胞功能和质量进行性下降的主要原因〔26〕。动物研究表明，BM-MSCs治疗可以不同程度地降低血糖水平，并再生胰岛和β细胞〔27，28〕。临床研究表明，华通胶MSCs移植改善了T2D患者的代谢水平和β细胞功能〔29〕。Zhao等〔19〕通过与BM-MSCs共培养的INS-1细胞研究发现：BM-MSCs可增强β细胞的自噬能力，从而保护β细胞免受HG的慢性损伤。此外，体内研究显示BM-MSCs输注可调节T2DM大鼠胰腺的自噬活性。

2.2肝细胞 I/R被广泛认为是肝损伤的一个重要因素，I/R可能会导致肝大部切除术后的肝功能衰竭。血红素加氧酶(HO)-1是一种应激诱导酶，具有抗炎、抗凋亡和抗氧化等功能。HO-1已被证实能通过调节氧化应激或炎症来保护肝脏I/R损伤〔30〕。此外，研究发现HO-1也可通过自噬减轻肝脏I/R损伤〔31〕。BM-MSCs移植治疗大鼠肝脏I/R损伤的研究中发现，BM-MSCs可减轻I/R损伤，促进HO-1的表达，增强自噬作用，而用3-甲基腺嘌呤(MA)抑制自噬、锌原卟啉IX抑制HO-1均可逆转BM-MSCs的治疗效果。这说明BM-MSCs可通过HO-1介导的自噬保护肝脏免受I/R损伤〔32〕。Jung等〔33〕在胎盘分离的绒毛膜板源性MSCs(CP-MSCs)移植治疗四氯化碳(CCl4)+损伤大鼠肝脏中发现：自噬表达水平显著增加。此外，CCl4处理的原代大鼠肝细胞与CP-MSCs共培养时，坏死细胞减少，自噬信号及再生因子增加。因此CP-MSCs可通过增加肝细胞自噬表达水平来促进肝细胞修复。

2.3胆管上皮细胞 原发性胆管炎(PBC)是一种器官特异性炎症性疾病，其组织学特征是小胆管的胆管炎，导致肝硬化并最终衰竭，有研究提示肝内胆管上皮细胞(IBECs)的自噬可能参与了该病进行性胆管丢失的发病机制〔34〕。STAT3与细胞能量代谢和细胞死亡密切相关，在感染性疾病中发挥着重要作用。STAT3通过降低dsRNA依赖的蛋白激酶R(PKR)的活性作为自噬的负调控因子〔35〕。Zhu等〔36〕在人肝内胆管上皮细胞(HIBEC)与人骨髓MSCs(hMSCs)共培养时发现：LC3-Ⅱ、PKR的表达增加，P62、pSTAT3、STAT3明显降低，自噬小体和自噬溶酶体的形成增加，自噬小体清除能力增强。STAT3沉默后，自噬水平无明显改变。MSCs可能通过抑制STAT3活性来增强HIBECs的自噬通量。

2.4神经细胞 慢性接触有机溶剂可导致中枢-外周神经病变，这种病变主要由其毒性代谢物2，5-己二酮(HD)介导。Hao等〔37〕在BM-MSCs移植治疗HD中毒的大鼠后发现：BM-MSCs显著降低HD中毒大鼠脊髓和坐骨神经LC3-Ⅱ的水平和P62的降解。此外，在暴露于HD的背部运动神经细胞中，BM-MSCs也下调了细胞自噬水平，PIKⅢ抑制自噬减轻了HD的神经毒性效应。 BM-MSCs不能干扰Beclin-1，但可以促进mTOR的激活。结果提示BM-MSCs移植通过Beclin-1非依赖性激活mTOR通路有效地改善了HD诱导的自噬，从而改善神经元损伤和运动障碍。

2.5软骨细胞 骨关节炎(OA)是关节退行性变最常见的原因，在关节软骨的损伤中，软骨会受到细胞外基质代谢与软骨细胞死亡和功能障碍之间的失衡，而软骨细胞是软骨中唯一的驻留细胞〔38，39〕。因此软骨细胞是决定软骨退变的重要因素。Zhou等〔40〕在软骨细胞与AD-MSCs共培养时发现：AD-MSCs降低促炎因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达，抑制软骨细胞凋亡，上调LC3-Ⅱ、p-Akt/Akt，下调p62、p-Smad1/Smad1和p-CAMK Ⅱ/CaMKⅡ，3-MA预处理可逆转AD-MSCs对半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3的抑制作用，表明其抗凋亡作用与诱导自噬有关。此外，AD-MSCs治疗可减轻大鼠OA模型的OA。AD-MSCs可能通过p-Akt/Akt，p-Smad1/Smad1和p-CAMKⅡ/CaMKⅡ通路调控自噬减少促炎因子的分泌，保护软骨细胞免受凋亡。另外，Jiang等〔41〕研究发现AD-MSCs可通过mTOR通路介导的自噬调控抑制软骨细胞分解代谢。

2.6肺内皮细胞(PECs) PECs损伤是急性肺损伤(ALI)的重要病理过程。Zhou等〔42〕在BM-MSCs移植治疗ALI小鼠时发现：BM-MSCs移植显著减轻了小鼠ALI的严重程度，增加了PECs LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的表达，促进PECs存活，降低PECs中miR-142a-5p的水平。MSCs可能通过下调miR-142a-5p，增加Beclin-1介导的细胞自噬，从而减轻肺损伤。 Li等〔18〕在BM-MSCs与人肺微血管内皮细胞共培养时发现：BM-MSCs可降低PI3K Ⅰ类和p-Akt的表达，增加PI3K Ⅲ类的表达，增强自噬激活，降低细胞死亡水平以致降低内皮通透性。此外，自噬抑制剂LY294002可抑制BM-MSCs诱导的自噬活性。BM-MSCs可通过PI3K/Akt信号通路调控PECs自噬水平。

2.7T细胞 SLE是一种自身免疫性炎症性结缔组织病，自噬在SLE中发挥着重要作用〔43〕。Chen等〔44〕发现SLE患者T细胞比健康对照者的T细胞具有更高的自噬活性，在UC-MSCs与SLE患者的T细胞共培养时发现：UC-MSCs可抑制活化T细胞呼吸线粒体的生物发生，通过线粒体转移下调自噬，从而减少T细胞凋亡。此外，雷帕霉素(RAPA)激活自噬增加T细胞凋亡，而3-MA抑制自噬减少T细胞凋亡。UC-MSCs通过线粒体转移抑制SLE患者T细胞自噬，在SLE治疗中可能发挥重要作用。

3 MSC-Exo对细胞自噬的调节作用

MSC-Exo是复杂的细胞间通讯系统中最小的内源性膜结合型纳米囊泡，其主要功能是在细胞通讯中传递细胞类型的特定蛋白质和核酸，包括mRNAs和miRNAs，以调节细胞内的信号通路〔45，46〕。MSC-Exo可以通过不同通路调节心肌细胞、肝细胞和肾小管上皮细胞的自噬水平，从而发挥治疗作用。

3.1心肌细胞 缺血性心脏病(IHD)是目前世界范围内的主要死亡原因之一，I/R是IHD的主要治疗方法，然而，I/R也可能导致梗死扩大。Liu等〔21〕在MSC-Exo与大鼠缺氧心肌细胞H9C2共培养时发现：Beclin 1、LC3-Ⅱ和P-AMPK/AMPK表达增加，p-mTOR/mTOR与p-Akt/Akt表达降低。由此说明MSC-Exo可通过AMPK/mTOR和Akt/mTOR途径诱导心肌细胞自噬，从而降低心肌缺血I/R损伤(MIRI)。然而，Jiang等〔47〕研究发现hMSC-Exo可通过B细胞淋巴瘤(Bcl)-2的上调抑制心肌细胞I/R诱导的凋亡和自噬的激活。Xiao等〔48〕研究发现MSC-Exo中富含miR-125b-5p，miR-125b-5p的靶基因是p53。在缺氧和去血清培养的新生小鼠心肌细胞与MSCs或MSC-Exo共同培养时，p53-Bnip3通路活性及细胞的自噬通量和细胞死亡下降，但外泌体抑制剂GW4869基本消除这些改变。此外，体外实验发现移植的MSCs治疗改善了心功能和梗死面积，同时减少了凋亡和自噬流量的测量。结果表明，MSC-Exo分泌的miR125b-5p可通过p53/Bnip3信号转导调控心肌细胞自噬，从而改善心功能。MSCs对于自噬水平的调节是基于受损细胞的一个自噬状态。所以，MSC-Exo无论是上调还是下调心肌细胞自噬水平，对于受损心肌细胞发挥的都是保护作用。

3.2肝细胞 急性肝衰竭(ALF)是由炎症介导的肝细胞损伤并伴有肝细胞凋亡和坏死所引起的临床综合征。Zhao等〔49〕在BMSC-Exo与肝细胞损伤和凋亡模型共培养时发现：BMSC-Exo增强LC3和Beclin-1的表达，促进自噬小体的形成；Bcl-2-Associated X的蛋白质(Bax)和裂解Caspase-3的表达水平明显降低，而Bcl-2的表达水平上调。此外，3-MA可逆转BMSC-Exo抑制凋亡的作用。结果表明BMSC-Exo通过促进肝细胞自噬来减轻肝细胞凋亡，具有减少ALF后肝细胞凋亡的潜力。

3.3肾小管上皮细胞 顺铂是临床上广泛使用的广谱抗肿瘤药物之一，然而肾毒性是顺铂治疗最严重、最常见的副作用。Wang等〔50〕在顺铂诱导的大鼠肾小管上皮细胞与hucMSC-Exo共孵育时发现：hucMSC-Exo可上调LC3B和自噬相关蛋白(ATG)5、ATG7的表达，抑制mTOR磷酸化和线粒体凋亡和炎性细胞因子的分泌。hucMSC-Exo可通过抑制肾近端小管上皮细胞mTOR信号通路激活自噬，从而减轻早期细胞凋亡和炎症反应，效减轻顺铂的肾毒性。因此，hucMSC-Exo预处理可能是提高顺铂疗效的一种新方法。

4 MSCs-CM对细胞自噬的调节作用

MSCs-CM含有多种细胞因子和神经营养因子，支持组织修复和再生。因此MSCs-CM可通过调节神经细胞自噬水平，发挥对疾病的治疗作用。

Zhang等〔51〕在BMSC-CM干预HD诱导的运动神经元时发现：BMSC-CM可降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，增加P62表达，减少自噬空泡数量。此外，BMSC-CM可增加NGF、p-Akt、mTOR的表达。因此BMSC-CM可能通过激活NGF-PI3K/Akt/mTOR来抑制HD诱导的神经元自噬。

阿尔茨海默病(AD)是一种进行性神经退行性疾病，俗称“老年性痴呆”。AD的特征是细胞外沉积Aβ，胶质增生和神经元丢失。而小胶质细胞参与了AD的发病和进展。Xu等〔25〕将小胶质细胞BV2与ucMSCs-CM共孵育后发现：ucMSCs-CM逆转了Aβ25-35诱导的BV2细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的升高，解除了对Beclin-1和P62的抑制，上调了Aβ降解酶的表达，抑制BV2细胞增殖和细胞死亡，促进对Aβ25-35的吞噬。ucMSCs-CM通过调节小胶质细胞的自噬和增强Aβ降解酶的表达来保护小胶质细胞。由上可知，MSCs-CM 可通过抑制受损神经细胞的自噬水平，从而保护细胞，但具体是MSCs-CM 中的哪种或者哪些成分发挥的保护作用，则需要进行更深入的实验研究。

5 MSCs 研究现状

到目前为止，注册MSCs临床研究的总共有9 233个。MSCs对于终末期肝病、下肢缺血性疾病、炎性肠病、肾病等疾病都有不错的疗效。

MSCs对于心脏疾病也有一定的作用。MSCs可通过多种机制启动心肌修复，包括促进新生血管、抑制细胞凋亡和抑制心肌肥厚。有研究人员评估了三种剂量的自体或同种异体BM-MSCs对IHD患者的影响。研究表明，所有剂量都对患者的能力和心室转换有积极影响，而且自体BM-MSCs冠状动脉内移植3个月后，左心室射血分数(LVEF)显著改善〔52〕。此外，在随机对照试验中，有学者对非IHD患者的同种异体BM-MSCs和安慰剂对照进行了比较，结果表明，左心室功能有趋于完善的趋势〔53〕。

MSCs可通过与广泛的免疫细胞如T、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突细胞相互作用来调节适应性和先天免疫系统。因此MSCs也被用于治疗各种免疫疾病，如移植物抗宿主病(GVHD)、SLE和多发性硬化症(MS)。

UC-MSCs通过调节SLE患者转化生长因子-β和前列腺素E-2的水平，增加调节性T细胞(Treg)，降低Th17细胞〔54〕。一项临床研究发现同种异体BM-MSCs使难治性SLE患者在12～18个月内病情稳定缓解，Treg细胞上调〔55〕。GVHD是一种难治性甚至致死性疾病，通常发生在异体造血干细胞移植后。在急性GVHD环境下，特别是激素难治性GVHD，通常向患者输注异体BM-MSCs〔56〕。结果显示，7例激素难治性急性GVHD患者中有5例完全改善，炎性细胞因子迅速减少，存活率显著延长，基线淋巴细胞绝对值高〔57〕。另一项研究24例患者中有17例对异基因BM-MSCs输注有改善作用〔58〕。MS是中枢神经系统的一种炎症性疾病，以脱髓鞘和神经退行性疾病为特征。到目前为止，MS患者还没有明确的治疗方法，BM-MSCs正在成为最有前景的治疗方法之一。这些临床试验中的大多数都是采用自体BM-MSCs进行的，并通过髓鞘内输注给药。在注射MSCs一年后发现，MSCs移植能够改善或延缓难治性MS的疾病进展〔59〕。

综上，对于细胞治疗，MSCs可以直接应用于受损组织，也可以以细胞外小泡的形式使用，其中包含MSCs以自分泌或旁分泌方式产生的生物活性分子，特别是生长因子和免疫调节分子。MSCs移植是目前治疗各种疾病的一种非常有应用前景的治疗方法，但其具体机制并不是十分明确，但在最终广泛应用于临床前，仍有相当大的挑战需要克服。MSCs制备、最佳细胞类型、给药剂量、给药途径和安全性等问题都需要统一解决。自噬是真核细胞中溶酶体对受损或老化的细胞器和大分子进行生物降解的有序过程，在MSCs治疗过程中发挥着重要的作用。但自噬与MSCs治疗之间的具体机制目前不是很清楚，仍需大量的临床前研究去明确阐述其作用机制，以便将来更好地应用于临床。