兰花种苗远缘杂交高效繁育技术研究

2022-12-30章来军

四川农业与农机 2022年6期

章来军

杭州市园林绿化股份有限公司，浙江杭州

兰花虽然是一种具有较高观赏价值的园艺植物，但是普通的兰花品种生长速度慢、养护难度高、繁育难度较大，导致兰花无法大面积地应用于园林绿化施工。虽然兰花种苗可以自然分株繁殖，但是繁殖速度较慢，难以满足市场应用的需求[1]。当前主要是通过组织培养等技术大量培养种苗实现快速兰花繁育。为提高种苗繁育效率，普遍采用技术加快种苗生长速度。然而这种繁育技术容易造成兰花的抗性降低、相关性状发生变化，影响后续繁育兰花品质[2]。

远缘杂交技术利用亲缘关系较远的兰花杂交，改善兰花繁育过程中表现出的不良形状。杂交物种优势能够更加快捷地提高繁育速度与繁育后代植株的质量。因此，本文将利用远缘杂交原理对兰花种苗进行繁育。

1 兰花种苗繁育现状

兰花繁育主要是利用种子、分株培养、组织培养、多倍体诱导四种方式。其中，利用种子繁育兰花不仅受到兰花生长速度缓慢的限制，而且因为兰花种子发芽率低、部分兰花品种不依靠种子进行繁殖，增加了繁育难度。分株培养能够提高繁育速度，但是对于兰花母株的伤害较大，无法大规模应用。组织培养降低了对于兰花母株的损伤，适用于大规模繁育[3]。但是组织培养会造成兰花毒素累积，而脱毒处理增加了兰花繁育成本。多倍体诱导的繁育方式会改变种苗的性状，提升种苗质量。但是多倍体诱导时，无法控制兰花种苗性状发生改变的方向，并且化学诱导对于试验人员的危害较大。此外，多倍体诱导后的兰花极容易出现后代性状不稳定等问题，繁育成本较高，应用存在局限性。

2 远缘杂交繁育材料与过程

2.1 繁育材料与准备

2.1.1 亲本兰种

从某地农业科技园区C 中选择兰种作为远缘杂交的杂交亲本。其中，选择野生兰种作为繁育亲代父本，分别编号为Y1、Y2；选择具备目标繁育特性的兰种A1、A2、A3、A4 作为繁育亲代母本。植株亲代的母本和父本兰种在杂交过程中不可以互换。记录所有亲本的株高、形态、叶片信息、花冠信息、生长期特性等主要性状，同时，确定亲本性状可以稳定遗传表现，以保证杂交育种可靠性。

2.1.2 繁育工具与试剂

杂交试剂：青霉素溶液、医用级凡士林、无水氯化钙等。

测试试剂：培养基成分（高纯度蔗糖、硝酸铵、硝酸钾、磷酸氢钾、含水磷酸氢钠、硼酸、硫酸镁、硫酸铁、6-BA、NAA、卡拉粉）

上述所有选用的杂交试剂和测试试剂均达到国产分析纯标准。

杂交工具仪器：VD650/HD650超净工作台、ME204E电子天平、试管、干燥器、消毒脱脂棉、无菌标签、筛子、研钵等。

2.2 远缘杂交预处理过程

杂交处理前，以盆栽的形式将所有待杂交处理的兰种分别放置在相同条件的玻璃温室内，以免进行亲本间远缘杂交操作时出现不可控因素。温室环境的温度、湿度、日照等条件均与兰花自然生长设置一致。同时，温室内只保留所选择的亲本种类兰种，避免影响杂交结果。

2.2.1 亲本植株处理

在父本兰种的开花期，从开花姿态旺盛的植株上采集花粉。摘取处于露色期父本的花蕾，并标注对应的父本兰种种类。使用无菌脱脂棉将花药存放至加有无水氯化钙的干燥器中。待24 h 后花药完全干燥后，转移并拍打花药，由筛子将散出的花粉与花药分离。每一次采集花粉操作后，需要完全清洁操作台，避免花粉混合。收集后的花粉低温密封保存，并注明对应信息[4]。

从母本中选择长势良好的植株，去除发育明显缓慢的花蕾。剩余花蕾处于露色期时，摘除花瓣和雄蕊，并巡视套袋确保雌蕊正常发育。

2.2.2 亲本杂交状态测定

在对亲本开展杂交处理前，需测定父本花粉的生活力与母本雌蕊柱头的可授性。将采集的花粉分别放置于培养皿中，使用蒸馏水浸泡花粉形成糊状。取部分糊状花粉于盖玻片培养液中，分散花粉后制成显微玻片。将玻片放置在培养皿中，25 ℃培养10天。使用显微镜观察不同视野下的花粉萌发情况，按照下式计算花粉的有效萌发率[5]。

其中，mi为第i次观测时，视野j中的萌发花粉数量；Mij为第i次观测时，视野j中的花粉总量。

将1%联苯胺、3%过氧化氢、蒸馏水按照4∶11∶22的配比配制柱头可授性检测溶液。在培养基中，使用联苯胺反应液浸泡不同开花期的新鲜雌蕊柱头样本。反应10 min。在体视显微镜下观察气泡产生情况以及柱头变色情况。表1 为不同花期采集的亲本花粉和柱头的检测结果。

表1 兰种亲本花粉生活力与柱头可授性检测结果

由表1 可知，父本花期的第2~4 天花粉生活力最佳，而母本花期的第3天可授性增强，花期的第5天仍具有较好的可授性。

2.3 兰花杂交繁育技术

在亲代兰种的花期选择符合杂交要求的植株，对母本去雄处理后，将收集的母本花药进行相应的花粉采集处理。在每日的10 点前，将收集到的父本花粉由镊子移放至已经分泌粘液的母本柱头腔内。授粉过程中，去除母本兰种的唇瓣，避免干扰其他柱头授粉。为避免单次授粉失败，对每一母本植株共授粉3次。根据正向授粉的操作信息，对已授粉的母本植株进行信息标注。在授粉后的1~3 天内，观察授粉对应的花冠是否出现萎蔫、柱头粘液是否干硬。在完全授粉的3~12 天内，观察母本子房是否膨大，并进行套袋管理母本兰种，直至兰种结实成熟。按照下式计算母本植株的稔实率R和结实率J。

上式中，TP表示完全授粉后，母本植株雌蕊出现子房膨大的数量；TS表示正向杂交授粉的总花朵数量；TC表示母本果实的成熟数量。

按照上述过程，将从母本花药上采集的花粉授粉给父本雌蕊，完成反向杂交处理。记录反向杂交处理的稔实率和结实率。

2.4 子代种苗培养与管理

收集正向和反向杂交得到的兰花果实，对蒴果清洗、晾干后，处理蒴果得到杂交一代的兰花种子。将兰花种子按照标注信息，均匀地播撒在诱导培养基中。室温28 ℃、光照强度1 500 Lx 培养一段时间。待种皮破裂，种胚发育逐渐形成原球茎后，进行继代培养。

使用干净无菌的小刀分割原球茎，将2 cm3大小的原球茎块接种至继代培养基中，诱导原球茎块直至萌发成小苗。培养瓶中的小苗发育至具有5片真叶、萌发4~5条完整根系的主根、生长高度高于8 cm 时，移栽种苗至遮阴棚内炼苗2周。从培养瓶中取出苗体，蒸馏水清洗种苗根系残存的培养基。将种苗根系浸泡在800 倍多菌灵溶液15 min 后，通风晾干残存水分。在育苗穴盘中逐层放置蛭石、育苗土后，移栽种苗。控制种苗假鳞茎低于育苗盘0.5 cm左右。定期向移栽后的种苗叶片喷水，避免植株干燥。根据兰种的生长习性，待种苗根茎变粗、增高后，将兰种移栽至透气性良好的营养土中。按照常规兰花育苗过程对杂交一代种苗进行养护，观察F1 代种苗生长过程的性状，测量相关数据，对比亲本性状表现评估兰花远缘杂交效果。

3 繁育技术测试

文中提出了一种兰花远缘杂交的繁育技术，在繁育过程中选择相同数量的植株进行常规杂交繁育处理。通过对比不同繁育技术繁殖后，兰花的繁育效率和繁育效果，评估所提出的繁育技术是否具有实际应用价值。

表2为不同兰花母本和父本在两种技术繁育下，兰花F1代性状的变异系数和杂交子代的出苗率统计结果。

分析表2 中的数据可知，使用本文技术繁育得到的F1 代变异系数波动区间为14%~47%，高于常规繁育技术F1 代变异系数波动区间4%~12%。从变异系数来看，本文繁育技术对于F1 代的植株性状的改变程度较大，而常规技术相对较差。从出苗率来看，本文技术繁育后的兰花杂交种子的出苗率整体高于35%。而常规繁育技术的杂交种子出苗率存在明显差异，出苗稳定性较差。

表2 本文技术繁育F1代的变异系数和出苗率

图1~3 分别为使用不同繁育技术培育的兰花F1 代的花量、花期、植株高度性状与亲本平均值的对比曲线。

图1 F1代兰花种苗花量对比

图2 F1代兰花种苗花期对比

图3 F1代兰花种苗植株高度对比

对比分析图1~3 可知，使用本文提出的繁育技术培育的F1 代兰花大部分花量、花期、植株高度都较亲代有不同程度的提升。而使用常规技术培育的种苗性状表现较差，只有少部分种苗性状表现较亲本提升。由观赏价值分析，本文技术培育出的杂交兰花后代具有较高的观赏价值。结合F1 代的变异系数可知，本文技术繁育出不同性状的兰花数量较多，有效提升了种苗的繁育效率。