白藜芦醇对腔隙性脑梗死大鼠脑损伤的影响

米晓璐，李百艳，李雅琴，朱保月，王维展

衡水市人民医院（哈励逊国际和平医院）急诊科，河北 衡水 053000

腔隙性脑梗死（lacunar infarction，LI）属于卒中亚型，是由于长期高血压致脑深部白质、脑干穿通动脉病变或闭塞而产生缺血性梗死。白藜芦醇（resveratrol，RES）是一种天然多酚类化合物，广泛存在于葡萄籽、虎杖等植物，具有抗癌、抗氧化损伤和抗炎等作用，被称为植物抗毒素。此外，RES 不仅对围绝经期抑郁症大鼠抑郁行为具有改善调节作用，还可以提高抑郁模型小鼠认知功能和改善慢性脑缺血大鼠的认知水平[1～3]。刘茅茅等[4]认为RES 对LI 大鼠脑损伤有改善作用，至今少有研究报道RES 在LI 的作用机制，本文通过制备LI 大鼠模型探究RES 对LI 大鼠脑损伤可能存在的作用机制，为治疗LI 药物设计提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级健康雄性7～8 周龄SD 大鼠60 只，体重250～300 g，购回饲养1 周，温度20～25 ℃，空气湿度50%～55%，人工光照12 h 昼夜交替，所有大鼠全天自由饮水。

1.1.2 主要试剂和仪器 丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）试剂盒（上海远慕生物科技有限公司）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（中国上海信帆生物科技有限公司）；白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-1β（IL-1β）试剂盒（中国上海歌凡生物科技有限公司），兔抗鼠磷酸化丝氨酸苏氨酸激酶（p-AKT）、磷酸化磷酸肌醇3 激酶（p-PI3K）、血管内皮生长因子（VEGF）抗体以及抗小鼠/兔IgG（美国CST 公司）；ECL Kit（美国Thermo Fisher 公司）；二氨基联苯胺（DAB）；白藜芦醇、LY294002（美国Sigma 公司）。DNR BioImaging System（以色列DNR 公司）；高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter 公司）；正置荧光显微镜（美国Thermo 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备 将60 只SD 大鼠随机分为假手术组、模型组、RES 组、联合组，模型组、RES 组、联合组大鼠按月桂酸钠法制备LI 模型[5]，1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，取颈部正中切口，分离大鼠右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，并结扎大鼠同侧枕动脉、甲状腺上动脉、翼腭动脉以及颈外动脉远心端。PE50 导管的前端接近颈总动脉分叉方向插入颈外动脉，注入1 mg/mL 月桂酸钠溶液0.1 mL，微动脉夹将颈总动脉暂时夹闭，注入完毕，拔管并结扎右侧颈外动脉。第1次注入月桂酸钠溶液48 h 后进行第2 次月桂酸钠溶液注入，注入剂量、操作步骤同第1 次，假手术组操作至分离动脉且不进行结扎以及溶液注射。

1.2.2 药物干预 RES 组、联合组首次注入月桂酸钠溶液后尾静脉注射40 mg/kg RES（DMSO 溶解），联合组采用注射仪脑室给药10 μmol/L LY294002 溶液10 μL（DMSO 助溶LY294002，PBS 稀释 为10 μmol/L 溶液）[6]，假手术组注射等体积生理盐水，于第2 次月桂酸钠溶液注入后24 h，评定各组大鼠的神经功能，然后处死大鼠。

1.2.3 神经功能 Zea-Longa’s 评分法[7]评估神经功能，0 分为无神经功能缺损，大鼠的双前肢可以完全伸展；1 分为轻度神经功能缺损，提起鼠尾，对侧前肢表现为屈曲；2 分为中度神经功能缺损，大鼠行走时出现打转，静止时大鼠身体不偏向对侧；3 分为中重度神经功能缺损，大鼠行走时出现打转，静止时大鼠身体偏向对侧；4 分为重度神经功能缺损，出现严重意识障碍，无法行走。

1.2.4 TTC 法检测脑梗死体积 神经功能评定结束后，麻醉处死大鼠，取出完整脑组织，-20 ℃速冻15 min，专用脑槽进行冠状切片，将脑片置于2% TTC 溶液、37 ℃恒温水浴避光25 min，PBS 洗3 次，甲醛固定24 h，整理脑片，图像采集。Image J 软件采集脑梗死面积，正常脑组织为红色，脑梗死组织为白色，脑梗死体积（mm3）=各层面梗死面积×各层厚度之总和，脑梗死体积百分比=（脑梗死体积/半球总体积）×100%。

1.2.5 酶联免疫法检测脑组织氧化应激、炎性因子水平 取0.5 g 全脑组织，加入组织细胞裂解液、蛋白酶抑制剂，研磨成匀浆，3000 r/min 离心20 min，取上清液检测MDA、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β 水平和SOD、CAT、GSH-PX 活性。重复3 次。

1.2.6 Weidener 法检测脑组织微血管密度 将已固定于4%甲醛中性溶液中全脑组织常规石包埋、切片，经过热修复、过氧化氢封闭，加入兔抗鼠CD34 多克隆抗体（1：500），4℃孵育过夜，加入二抗、孵育30 min，显色、复染、返蓝、脱水以及封片，对脑皮质区微血管密度进行统计，染成棕褐色的单个内皮细胞或者内皮细胞族作为一个血管计数，每张切片于同一皮层缺血区中选择4 个（×400）视野对微血管计数进行统计，Weidener 计数方法[8]，计算出1 mm2面积内微血管数量，即微血管密度。

1.2.7 Western blotting 检测 蛋白质提取试剂盒提取脑皮质组织蛋白，Bradford 调整蛋白浓度，依次经过SDS-PAGE 电泳、电转膜，密封2 h，加入兔抗鼠VEGF、p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K、GAPDH 一抗（1：500）4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记二抗（1：500）孵育1 h，ECL 试剂盒观察膜上蛋白条带，收集影像。重复3 次。

1.3 统计分析

运用SPSS 22.0 和GraphPad prism 5.0 软件，符合正态分布数据以均值±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用LSD-t 检验，检验水准a=0.05。

2 结果

2.1 RES对LI大鼠脑梗死体积、神经功能评分的影响

分析各组大鼠脑梗死体积和神经功能评分，结果显示RES 组、联合组大鼠的神经功能评分、脑梗死体积均低于模型组（P＜0.01），联合组大鼠均高于RES组（P＜0.01），说明RES 对LI 大鼠的脑梗死和神经功能有改善作用，而LY294002 可以部分抑制这个趋势（图1）。

图1 RES 对LI 大鼠脑损伤的影响A：大鼠脑组织TTC 染色B：大鼠脑梗死体积 C：大鼠神经功能评分#P＜0.05,与模型组相比 &P＜0.05,与RES 组相比n=5Fig.1 Effects of RES on brain damage in LI ratsA：TTC staining of brain tissues of rats；B：Volume of cerebral infarction of rats；C：Scores of nerve function of rats；#P＜0.05 vs model group;&P＜0.05 vs RES group; n=5

2.2 RES 对LI 大鼠脑组织氧化应激因子水平的影响

分析各组大鼠脑组织MDA、SOD、CAT、GSHPX，结果显示，模型组脑组织SOD、CAT、GSH-PX 活性明显低于假手术组（P＜0.05），而MDA 含量明显高于假手术组（P＜0.05）；RES 组、联合组脑组织SOD、CAT、GSH-PX 活性明显高于模型组（P＜0.05），MDA含量明显低于模型组（P＜0.05）；联合组大鼠SOD、CAT、GSH-PX 活性明显低于RES 组（P＜0.05），MDA含量明显高于RES 组（P＜0.05），说明RES 对LI 大鼠的氧化应激反应有改善作用，而LY294002 可以部分抑制RES 的改善趋势（图2）。

图2 RES 对LI 大鼠脑组织氧化应激因子水平的影响A：大鼠脑组织MDA 水平 B：大鼠脑组织SOD 活性 C：大鼠脑组织CAT 活性 D：大鼠脑组织GSH-PX 活性 *P＜0.05,与假手术组相比#P＜0.05,与模型组相比&P＜0.05,与RES 组相比n=5Fig.2 Effects of RES on levels of oxidative stress factors in brain tissues of LI ratsA：MDA level in brain tissues of rats；B：SOD activity in brain tissues of rats；C：CAT activity in brain tissues of rats；D：GSHPX activity in brain tissues of rats；*P＜0.05 vs sham operation group;#P＜0.05 vs model group;&P＜0.05 vs RES group; n=5

2.3 RES 对LI 大鼠脑组织炎性因子水平的影响

分析各组大鼠脑组织中TNF-α、IL-6、IL-10 和IL-1β 水平，结果显示模型组大脑组织TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均高于假手术组（P＜0.05），而IL-10 含量明显低于假手术组（P＜0.05）；RES 组、联合组大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 水平明显低于模型组（P＜0.05），IL-10 含量明显高于模型组（P＜0.05）；联合组大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均高于RES 组（P＜0.05），IL-10 含量明显低于RES 组（P＜0.05），说明RES 可以改善LI 大鼠脑组织中的炎症反应，而LY294002 可以部分逆转RES 的改善趋势（图3）。

图3 RES 对LI 大鼠脑组织炎性因子水平的影响A:大鼠脑组织TNF-α 水平B:大鼠脑组织IL-6 水平C:大鼠脑组织IL-10 水平D:大鼠脑组织IL-1β 活性**P＜0.05,与假手术组相比#P＜0.05,与模型组相比&P＜0.05,与RES 组相比n=5Fig.3 Effects of RES on levels of inflammatory factor s in brain tissues of LI ratsA: TNF-α level in brain tissues of rats; B: IL-6 level in brain tissues of rats C: IL-10 level in brain tissues of rats; D: IL-1β activity in brain tissues of rats;*P＜0.05 vs sham operation group;#P＜0.05 vs model group;&P＜0.05 vs RES group; n=5

2.4 RES 对LI 大鼠脑组织血管新生的影响

大鼠脑微血管密度和VEGF 蛋白表达检测显示，模型组微血管密度、VEGF 蛋白水平高于假手术组（P＜0.05），RES 组、联合组微血管密度、VEGF 蛋白水平高于模型组（P＜0.05），联合组微血管密度、VEGF 蛋白水平低于RES 组（P＜0.05），说明RES 可以促进LI大鼠脑组织血管新生（图4）。

图4 RES 对LI 大鼠脑组织血管新生的影响A:大鼠脑组织微血管密度 B: 大鼠脑皮质VEGF 蛋白表达 C: VEGF 蛋白表达数据柱状图 D: 大鼠脑组织微血管密度数据柱状图 *P＜0.05,与假手术组相比 #P＜0.05,与模型组相比 &P＜0.05,与RES 组相比n=5Fig.4 Effects of RES on angiogenesis in brain tissues of LI ratsA: Microvascular density in brain tissues of rats; B: Expression of VEGF protein in brain cortex of rats; C: Histogram of VEGF protein expression; D:Histogram of microvascular density in brain tissues of rats;*P＜0.05 vs sham operation group;#P＜0.05 vs model group;&P＜0.05 vs RES group; n=5

2.5 RES 对LI 大鼠PI3K/Akt 信号通路的影响

蛋白印记法检测脑组织PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达，结果显示模型组p-AKT、p-PI3K 蛋白表达低于假手术组（P＜0.05），RES 组、联合组p-AKT、p-PI3K 蛋白表达明显高于模型组（P＜0.05），联合组p-AKT、p-PI3K 蛋白表达低于RES 组（P＜0.05），说明LI大鼠脑组织中PI3K/Akt 信号通路活性降低，而RES可以提高LI 大鼠脑组织PI3K/Akt 信号通路的活性（图5）。

图5 RES 对LI 大鼠脑组织PI3K/Akt 信号通路的影响1.假手术组2.模型组3. RES 组4.联合组 * P＜0.05,与假手术组相比 #P＜0.05,与模型组相比 &P＜0.05,与RES 组相比 n=5Fig.5 Effects of RES on PI3K/Akt signaling pathways in brain tissues of LI rats 1, Sham operation group; 2. Model group; 3. RES group; 4, Combination group *P＜0.05 vs sham operation group;#P＜0.05 vs model group;&P＜0.05 vs RES group; n=5

3 讨论

RES 是植物受到外界胁迫时产生的一种天然多酚类药物，具有抗氧化、抗肿瘤以及治疗心血管疾病等作用[9～11]，本研究通过制备LI 大鼠模型探索RES 对LI 可能存在的作用机制，发现LI 会损伤脑组织结构，产生神经功能系统损伤，给予RES 干预可降低LI 大鼠脑梗死和神经系统损伤的严重程度，说明RES 对LI 大鼠脑损伤有改善作用。

脑组织缺血缺氧诱导脑组织坏死是神经功能受损的重要原因，脑组织氧化应激、炎症反应增加可引起神经功能损伤。MDA 是脂质过氧化的终端产物，SOD 是机体清除自由基的主要物质，CAT、GSH-PX均可减轻过氧化氢所致机体损伤。TNF-α、IL-6 均为促炎因子，IL-1β 可诱导其他炎性细胞因子产生、分泌TNF-α，IL-10 可反映机体抗炎程度。本研究发现LI大鼠脑组织SOD、CAT、GSH-PX 活性和IL-10 含量降低，而MDA、TNF-α、IL-6、IL-1β 含量升高，RES 可以部分逆转上述指标的趋势，此结果与文献报道相似[12,13]，说明LI 大鼠脑组织伴有氧化应激和炎症反应，而RES 可以改善LI 大鼠脑组织过度的氧化应激和炎症反应。

血管新生是脑组织缺血后神经修复的重要环节，能为神经再生提供足够氧及营养物质支持，本研究发现LI 大鼠脑组织微血管密度呈增长趋势，推测可能是当脑组织受到损伤时，会激发机体自身防御修复机制，促进脑皮质的新生血管生成，但是这种应激反应并不能完全修复LI 所致脑损伤。VEGF 能够促进血管内皮细胞增殖，诱导细胞外基质降解，促进新生血管形成。PI3K/Akt 信号通路可促进正常血管的发育以及肿瘤组织的血管生成，有研究显示PI3K/Akt 信号通路活化可以调控VEGF 表达水平，抑制该信号通路激活会降低VEGF 表达，抑制缺氧后内皮细胞增殖[14]，本研究发现LI 大鼠脑组织VEGF、p-AKT、p-PI3K 蛋白表达降低，此结果与上述研究相似，而RES可以部分逆转LI 大鼠脑组织中VEGF、p-AKT、p-PI3K 蛋白表达降低趋势，推测PI3K/Akt 信号通路可能参与LI 大鼠脑组织血管损伤过程，RES 对LI 大鼠脑组织血管新生促进作用可能与调节PI3K/Akt 信号通路活化有关。为验证此观点本研究在RES 干预基础上增加PI3K/Akt 信号通路抑制剂LY294002 处理，发现LY294002 可部分逆转RES 对LI 大鼠脑损伤、神经功能、氧化应激、炎症反应、血管新生的改善作用，已有研究表明丁基苯酞可以通过激活PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路减轻局部缺血性脑梗死大鼠的神经功能损伤，而增加LY294002 干预可以降低丁基苯酞促进p-Akt 表达水平[15]，本研究结果也呈现相似趋势，说明RES 对LI 大鼠脑皮质血管新生促进作用可能与激活PI3K/Akt 信号通路有关。

综上所述，RES 可通过改善LI 大鼠脑损伤和血管新生发挥脑保护作用，可能与激活PI3K/Akt 信号通路有关。