蒙药安神补心六味丸预防给药对心肌缺血大鼠的保护作用及氧化应激水平的影响＊

王 昆，武 娜，康 丽，王 烁，闫晓萍，史 瑞，张红丽＊＊

（1.内蒙古科技大学包头医学院 包头 014040；2.包头市第八医院 包头 014040；3.内蒙古自治区国际蒙医医院 呼和浩特 010065）

随着人民生活水平的提高，心肌缺血的患病率呈逐年上升的趋势，现已成为威胁中老人健康的罪魁祸首。心肌缺血是由于冠状动脉供血不足使心脏流通血液减少，导致心肌缺血和缺氧，从而出现不同程度的损伤，心肌损伤的程度与心脏的缺血时间与缺血程度相关，严重者会导致心肌梗死，危及患者的生命。

临床上治疗心肌缺血的药物有很多，主要采用西药治疗，通过扩张冠状动脉而增加心肌供血和供氧，虽然见效快，但只能治标不治本，同时，药物的长期服用会使冠状动脉产生耐受，药物的副作用会损害患者的其他器官。因此，寻找其他的治疗药物和新的治疗靶点，为心肌缺血的临床治疗提供更多的诊疗方案，减少心肌缺血患者的不良反应，一直是科学研究的目的和意义。

蒙药安神补心六味丸始载于《蒙医方剂汇编》，被收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册》（1998年版），由牛心、丁香、木香、枫香脂、肉豆蔻、广枣等6味药材组成，具有祛“赫依”，镇静等功能，主要用于心慌、气短之症[1]，其中，广枣有明显保护缺血心肌损伤的作用，唐丽等[2]研究显示广枣乙醇洗脱物可以改善心肌缺血大鼠心肌的损伤程度，缩小心肌缺血面积，表明广枣乙醇洗脱物对急性心肌缺血有明显的保护作用。研究显示[3]应用肉豆蔻五味丸可以使心肌梗死后大鼠的心肌细胞凋亡的数量减少,说明肉豆蔻五味丸对大鼠心肌梗死有一定的治疗效果。由此可见，蒙药安神补心六味丸组方中的药物对心肌缺血有一定的改善作用，且蒙药安神补心六味丸在临床上应用治疗冠心病和心绞痛多年，临床应用显示[4-5]，蒙药安神补心六味丸单独使用，疗效优于复方丹参滴丸对心肌缺血的治疗，与速效救心丸合用，对心肌缺血的治疗作用更显著，但对其物质基础、作用机理和作用靶点方面的研究未见报道。

本实验通过给大鼠单次腹腔注射异丙肾上腺素(Isoproterenol，ISO)5 mg/kg，复制急性心肌缺血动物模型[6-8]，这种方法在国际上广受认可[9-10]，传统的手术造模方法，死亡率较高，本方法既能降低模型制造过程死亡率，又能模拟临床上的心肌缺血症状，因此备受科研工作者的青睐。本实验应用此方法研究蒙药安神补心六味丸对心肌缺血模型保护作用，并对其相关作用机制进行初步探索。扩大蒙药安神补心六味丸在临床上的应用，也为心肌缺血的临床治疗提供新的治疗思路。

1 材料与方法

1．1仪器和材料

BL-420S BL系列生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；MULTISKAN GO全波长酶标仪（美国/Thermo）；UV-1780紫外可见分光光度计（岛津仪器有限公司）；TG16WS高速离心机（湘智离心机仪器有限公司）；00000246电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；GZX-9023MBE数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）；HHHS-11-1电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司）。

蒙药安神补心六味丸（乌兰浩特中蒙制药有限公司，产品批号：200203），复方丹参滴丸（天士力医药集团有限公司，产品批号：200443），盐酸异丙肾上腺素ISO（北京索莱宝科技有限公司，产品批号：1113D02 1），羧甲基纤维素钠（北京索莱宝科技有限公司，产品批号：727R022），肌酸激酶（CK）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，产品批号：20201010），肌酸激酸同工酶检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，产品批号：20201010），乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，产品批号：20201010），谷草转氨酶（AST/GOT）测试盒（南京建成生物工程研究所，产品批号：20201010），无毒环保H-E染液（南京建成生物工程研究所，产品批号：20201010），超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，产品批号：20201010），丙二醛（MDA）测试盒（南京建成生物工程研究所，产品批号：20201010），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PH）测试盒（南京建成生物工程研究所，产品批号：20201010）。

1.2 实验动物

SD大鼠，雄性，SPF级，60只，体重200-220 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2019-0010。

1.3 实验方法

1.3.1实验动物分组、给药及模型制备

将实验大鼠60只按体重分为空白组、模型组（ISO 5 mg/kg）、复方丹参滴丸组（405 mg/kg）以及蒙药安神补心六味丸低剂量组（270 mg·kg-1）、中剂量组（540 mg·kg-1）、高剂量组(1080 mg·kg-1)。每组10只，按不同剂量连续灌胃14天，1次/天。各组大鼠均进行灌胃给药(20 mL·kg-1)。其中，蒙药安神补心六味丸用0.5%的羧甲基纤维素钠配制成混悬液，空白组和模型组给与相同剂量的0.5%的羧甲基纤维素钠。给药第14天，模型组、复方丹参滴丸组和蒙药安神补心六味丸低中高剂量组均通过腹腔注射给与异丙肾上腺素（5 mg/kg）1次，制造心肌缺血急性模型，空白组腹腔注射等容量的生理盐水。

1.3.2检测指标

（1）心电图的测定

给药第14天，灌胃给药后1 h，经腹腔注射3%戊巴比妥麻醉，记录大鼠正常状态下的标准Ⅱ导联心电图，空白组动物腹腔注射生理盐水（10 mL/kg），模型组、阳性药组和蒙药安神补心六味丸低、中、高剂量组动物均腹腔注射ISO 5 mg(10 mL/kg)。记录各组注射后第5、10、20、30 min的肢体标准Ⅱ导 联心电图。

（2）血清中生化指标的测定

心电图测定后，取血，通过离心分离血清（3700 rmp，10 min）。通过试剂盒检测，测定血清中CK、CK-MB、LDH、AST、SOD、MDA和GSH-PX的含量。

（3）心肌组织HE染色

取血后处死大鼠，取心肌组织固定，制作石蜡切片，进行苏木精-伊红(HE)染色，观察染色切片在光学显微镜下的形态学差异。

1.3.3统计学分析

数据采用SPSS16.0统计软件进行数据处理分析，数据以均数±标准差（xˉ±s）表示，组间比较采取单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 大鼠心电图ST段表达比较

在腹腔注射ISO前，记录各组大鼠正常状态下心电图ST段，比较各组间变化，无统计学差异(P＞0.05)。造模后（注射ISO），空白组无显著变化，与空白组相比，模型组大鼠心电图在造模后5、10、20、30 min均出现ST段显著或极显著提高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，低剂量蒙药组只在造模后20 min表现出ST段显著降低（P＜0.05），复方丹参滴丸组和中高剂量蒙药组在各个时间点都的有明显的改善，且有显著意义。结果如表1所示。

表1 蒙药安神补心六味丸对心肌缺血大鼠心电图ST段动态变化的影响（±s，n=10）

表1 蒙药安神补心六味丸对心肌缺血大鼠心电图ST段动态变化的影响（±s，n=10）

注：与空白组相比，*表示具有显著差异P＜0.05，**表示具有极显著差异P＜0.01；与模型组相比，#表示具有显著差异P＜0.05，##表示具有极显著差异P＜0.01，###表示具有高度显著差异P＜0.001。

?

2.2 各组大鼠血清中心肌酶学相关生化指标

模型组大鼠与空白组大鼠相比，LDH、CK、CKMB、AST活力均显著升高(P＜0.05)；复方丹参滴丸组大鼠与模型组大鼠相比CK-MB活力极显著降低(P＜0.01)、AST活力显著降低(P＜0.05)；与模型组相比，蒙药安神补心六味丸低剂量组，血清中LDH活力显著降低(P＜0.05)，CK-MB活力极显著降低(P＜0.01)，CK和AST活力下降，但无显著性差异；蒙药安神补心六味丸中剂量组，血清中LDH、CK、CK-MB活力均显著降低(P＜0.05)，AST活力高度显著降低(P＜0.001)；蒙药安神补心六味丸高剂量组，血清中LDH、CK、CK-MB活力均显著降低(P＜0.05)，AST活力下降，但无显著性差异。结果如表2所示。

表2 蒙药安神补心六味丸对急性心肌缺血模型大鼠血清中LDH、CK、CK-MB、AST的影响（±s，n=10）

表2 蒙药安神补心六味丸对急性心肌缺血模型大鼠血清中LDH、CK、CK-MB、AST的影响（±s，n=10）

注：与正常组比较，*表示具有显著差异P＜0.05，**表示具有极显著差异P＜0.01；与模型组比较，#表示具有显著差异P＜0.05，##表示具有极显著差异P＜0.01，###表示具有高度显著差异P＜0.001。

?

2.3 HE染色结果

心肌组织HE染色分析，空白组：心肌纤维排列整齐，胞浆被上色匀称，间质没有水肿。模型组心肌纤维肿胀，多处折断，内膜细胞局部排列错杂凌乱，间质水肿。复方丹参滴丸组：心肌纤维排列较整齐，与模型组相比，有较明显的改善。蒙药安神补心六味丸低、中、高剂量组：心肌纤维排列较整齐，与模型组比较间质水肿也有明显的改善。结果如图1所示。

图1 各组大鼠心肌组织病理学表现（HE染色，×40）

2.4 各组大鼠血清氧化应激指标的变化比较

模型组大鼠与正常组大鼠相比，SOD活力显著降低(P＜0.05)，GSH-PX活 力 高 度 显 著 降 低(P＜0.001)，MDA活力显著升高(P＜0.05)。复方丹参滴丸组大鼠与模型组大鼠相比，SOD和GSH-PX活力均高度显著升高(P＜0.001)，MDA活力显著降低(P＜0.05)。与模型组相比，安神补心六味丸低剂量组，MDA活力降低，SOD活力升高，但未见显著性差异，GSH-PX活力高度显著升高(P＜0.001)；安神补心六味丸中剂量组，MDA活力显著降低(P＜0.05)，GSH-PX活力高度显著升高(P＜0.001)，SOD活力升高，但无显著性差异；安神补心六味丸高剂量组，MDA含量显著下降(P＜0.05)，SOD，GSH-PX活力极显著升高(P＜0.01)。结果如表3所示。

表3 蒙药安神补心六味丸对急性心肌缺血模型大鼠血清中MDA、SOD、GSH-PX的影响（±s，n=10）

表3 蒙药安神补心六味丸对急性心肌缺血模型大鼠血清中MDA、SOD、GSH-PX的影响（±s，n=10）

注：与正常组比较，*表示具有显著差异P＜0.05，**表示具有极显著差异P＜0.01；与模型组比较，#表示具有显著P＜0.05，##表示具有极显著差异P＜0.01，###表示具有高度显著差异P＜0.001。

?

3 讨论

当今社会，人口老龄化日趋严重，加上居民饮食习惯的改变，使得心血管疾病成为危害我国居民生命健康的主要疾病，也是形成死亡的主要因素之一。心肌缺血作为常见的心血管临床病症，其发病原理是由于冠状动脉紧急快速的关闭堵塞、使得血管内可以提供的血液迅速减少或中止供应因而引起的急性心肌缺血，并使得相应区域心肌发生时间较久的严重的缺乏供氧、缺乏血液导致，使心肌组织出现不同程度的损伤。异丙肾上腺素能激动β1和β2两种受体，作用于心肌β1受体，使心肌收缩力增强，心率加快，心输出量增加，使心肌耗氧量增加；作用于外周血管的β2受体，使血管扩张，引起血压降低，致使冠状动脉供血不足，从而导致心肌缺血。注射异丙肾上腺素诱导心肌缺血模型的造模方法简单易行，省时省力，适合于药理和药效的研究。

研究发现[11-15]，心肌组织的心态学变化和血清中酶（CK、CK-MB、LDH、AST）含量可作为对心肌缺血的评判依据，在正常情况下，血清中乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）及天门冬氨酸氨基转移酶（AST）含量较低，当发生心肌缺血或心肌梗死时，随着心肌组织病理性改变，会使血清中的这些酶显著增加。心电图的ST段抬高在临床上作为心肌缺血最为直观的观测指标，ST段代表的是心室肌在完成除极化后，处在去极化状态，正常状态下，ST段接近等电位线，无电位差，当心肌出现缺血时，心室肌在完成除极化后，电位差仍然存在，就出现的ST段抬高的现象。所以，可通过观察ST段升高的幅度来判定是否造成心肌缺血。

本次实验采用异丙肾上腺素（ISO）来制备急性心肌缺血大鼠模型，观察蒙药安神补心六味丸对其的保护机制与作用，从中得到结果显示，模型组大鼠与正常组大鼠相比，心电图ST段抬高，血清内的CK、CKMB、LDH、AST含量升高，心肌组织HE染色显示心肌组织严重损伤，证明本实验方法造模成功。蒙药安神补心六味丸组与模型组相比，中高剂量组使心电图ST段抬高显著下降（P＜0.05），血清内的CK、CK-MB、LDH含量显著降低（P＜0.05），心肌组织损伤有明显改善，证明蒙药安神补心六味丸对大鼠心肌缺血症状有较好的治疗效果，蒙药安神补心六味丸可缓解异丙肾上腺素诱导的大鼠急性心肌缺血所致的心电图ST段抬高，能够改善大鼠血清中相关心肌酶学生化指标和心肌形态学变化，有效缓解病情，有优良的抗心肌缺血作用。

蒙药安神补心六味丸由牛心、丁香、木香、枫香脂、肉豆蔻、广枣等6味药材组成，具有祛“赫依”，镇静等功能，主要用于心慌、气短之症。分析本方，方中以味甘，性湿、腻、重而有镇赫依，止痛之良药--牛心为主药，以补心、止痛；辅以广枣以强心、镇静；配以肉豆蔻以镇心赫依；丁香以抑制主脉赫依；枫香脂以燥希拉乌素、止痛；佐以木香调理赫依血不和。以上诸药配伍，有止痛、强心、镇静、宁心之功效[1]。其中，广枣与肉豆蔻在很多蒙药方剂中有联合应用，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准.蒙药分册》（1998年版）中的就有11个，9个用于心血管疾病的治疗。广枣提取物体内和体外实验均显示，广枣可清除体内过多的自由基，具有一定的抗氧化作用，广枣对心肌缺血损伤有保护作用[16]，研究显示，可能与广枣的抗氧化应激作用密切相关[17]。张慧芸等[18]发现丁香水提物及乙醇提取物可提高细胞内SOD、CAT和GSH-Px酶的活性、降低氧化产物的含量，从而达到抗氧化作用。丁香水提物可以清除体内的O2-自由基，具有抗氧化的作用[19-20]。

近年来研究表明，心肌缺血发生后，心肌细胞磷脂酶激活，导致细胞膜损伤、通透性增高和氧自由基聚集，堆积的氧自由基使细胞膜发生脂质过氧化，脂质过氧化物MDA水平升高，SOD和GSH-Px是体内重要的抗氧化酶，可以清除体内的自由基，心肌发生损伤后，SOD和GSH-Px的活性下降，对体内自由基的清除能力下降，会使自由基进一步堆积，MDA的水平进一步升高[14]。

本实验研究发现，与空白组相比，模型组大鼠血清内MDA含量升高，氧自由基清除的抗氧化酶SOD、GSH-Px活性下降，说明在异丙肾上腺素制造的心肌缺血模型中，发生了氧化应激水平的变化。与模型组相比，蒙药安神补心六味丸使模型组大鼠血清内的MDA含量呈下降趋势，血清内的抗氧化酶SOD、GSHPx活性呈升高趋势，且只有高剂量组（1080 mg/kg）使模型大鼠血清内的MDA活性显著降低，SOD、GSH-Px活性显著升高，与阳性药物复方丹参滴丸的作用相当。提示蒙药安神补心六味丸对大鼠心肌缺血的改善作用与氧化应激机制密切相关。