基于网络药理学和分子对接探讨补肾活血方治疗尿酸性肾病的作用机制＊

张单华，陈凯丽，邓 伟，季东方，王玉娟，闫文君

（1.河南中医药大学第一临床医学院 郑州 450000；2.河南中医药大学第一附属医院 郑州 450000）

尿酸性肾病（uric acid nephropathy，UAN）又称痛风性肾病、高尿酸血症肾病，是由嘌呤代谢异常而引起的肾脏损伤性疾病[1]。研究表明，尿酸可经炎症机制、损伤内皮功能、氧化应激(OS)、激活RAS系统等途径损伤肾脏[2-3]。近年来随着人们生活质量的提高，饮食结构逐渐发生变化，高尿酸血症的患病率在全球范围内迅速上升，导致UAN的发病率也随之不断升高，而UAN起病隐匿，早期无明显的症状，往往被忽视而错过最佳治疗时期，对国民健康来说，是一种重要威胁[4-6]。目前，西医在降尿酸方面临床疗效显著，但具有一定的副作用和禁忌症[7-8]，如常用的抑制尿酸排泄药物别嘌醇和非布司他具有引起过敏反应和损伤肝肾功能的可能；促进尿酸排泄药物苯溴马隆禁用于严重肾功能损伤、严重肾结石等患者[5]。近年来，中医药在防治UAN及改善肾损伤方面取得了良好的疗效[9-12]。因此，从中医药方面寻求治疗UAN方案多样化，了解其治疗机制，对防治UAN意义重大。

中医古籍中无尿酸性肾病对应病名，现将其归属于祖国传统医学＂痹证＂、“水肿”、“尿浊”等范畴。本病属本虚标实之证，以气虚肾亏为本，湿热、痰浊、瘀血为标，其中又以瘀血为重[5,13]。故本课题组在长期临床经验及疾病病因病机的基础上，总结归纳出补肾活血方，由黄芪、丹参、菟丝子、莪术、大黄五味中药组成。前期研究已表明[14-15]，补肾活血方在治疗UAN，改善肾功能，防治肾间质纤维化等方面有较好的疗效。但其治疗UAN，改善肾损伤的具体作用机制及靶标尚不明确。网络药理学是将药物靶标和病证相关分子共同映射于生物分子网络，强调从系统层次和生物网络的整体角度出发，与中医药学的整体论思想一致，为中医从经验医学转化为循证医学体系提供了新的研究范式[16-17]。因此，本研究在前期基础实验和课题资金的资助下，通过网络药理学探讨补肾活血方治疗UAN的可能调控机制。并采用分子对接技术和动物实验进行验证，旨在探明补肾活血方治疗UAN的潜在价值，并对药物作用机制进行探讨，以期为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 补肾活血方活性成分及靶点预测

基于TCMSP系统药理学数据库及分析平台，设定口服生物利用度（OB）≥30，类药性（DL）≥0.18，获得补肾活血方的活性成分[18-20]。然后利用PubChem、DrugBank、SymMap和SwissTargetPrediction数据库，对中药进行靶点预测。最后利用Uniprot数据库对靶点蛋白名称进行标准化处理。

1.2 尿酸性肾病的疾病靶点获取

通过GeneCards、DisGenet、malaCards和OMIN数据库，以“Uric acid nephropathy”为关键词进行筛选，其中GeneCards相关度评分Score＞20为条件，获取尿酸性肾病相关的疾病靶点。

1.3 补肾活血方与UAN疾病共同靶点Venn图构建

采用Venn diagrams在线绘图工具将UAN疾病相关靶点和补肾活血方靶点取交集，绘制靶蛋白韦恩图，筛选中药-疾病点共同靶靶点。

1.4 “药物-活性成分-疾病-靶点”网络图构建

将筛选获得的补肾活血方和疾病的交集靶点和其对应的活性成分、中药导入Cytoscape 3.9.0软件，构建中药-活性成分-交集靶点-疾病图。

1.5 PPI网络拓扑分析及核心靶点的筛选

首先，将中药-疾病共同靶点导入在线STRING数据库得到扩展的蛋白互作（PPI）网络数据信息，下载PPI网络互作信息。并采用Cytoscape3.9.0构建PPI互作图。其次，使用CytoNCA[21]插件计算每个网络节点的DC值，筛选出DC＞2倍DC中位数（54）的节点。最后，按照特征向量中心性（EC）、信息中心性（IC）、局部平均连通性法（LAC）、介数中心性（BC）、接近中心性（CC）[22]等拓扑学属性的中位数筛选核心靶点。

1.6 中药有效成份GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

采用DAVID数据库对获取的核心靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路功能富集分析。利用RStudio对分析结果按照P值＜0.05的标准进行筛选，选择排名前10的GO富集分析和排名前20的KEGG富集分析结果进行可视化处理，阈值P＜0.05。

1.7 分子对接

选择补肾活血方排名前6的活性成分与核心靶点进行分子对接。①通Pub Chem网站检索和下载主要活性成分的SDF结构（2D结构）文件，并运用Open Babel 2.3.2软件转化SDF文件，将其保存为PDB文件。②利用PYMOL 2.3.4软件对核心靶点蛋白进行去除水分子、去除配体等操作。并采用AutoDock Tools软件进行加氢、平衡电荷等修饰，最后将受体蛋白和配体小分子分别转化为BQTPD格式。③利用AutoDock Vina软件对受体蛋白与配体小分子进行分子对接，最后获取其构象。

1.8 动物实验

1.8.1实验动物

健康8周龄SPF级雄 性SD大鼠34只，体质 量（200±20）g，郑州惠济区华兴动物养殖场提供，合格证号SCXK（豫）2019-0002。本实验经河南中医药大学第一附属医院实验动物福利伦理审查委员会批准，编号YFYDW2018026。

1.8.2主要试剂仪器

补肾活血方组成：黄芪30 g，丹参30 g，菟丝子15 g，莪术10 g，制大黄10 g，共计40 g，其中黄芪、菟丝子、莪术、制大黄颗粒剂与生药换算比值分别为：3∶20，1∶20，1∶20，1∶6（江阴天江药业有限公司，批号分别为20116104、19126014、20036464、19126634）；丹参颗粒剂与生药比例9∶50（广东一方制药有限公司，批号：0070722）；非布司他片（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：200819JA）；盐酸乙胺丁醇片（沈阳红旗制药有限公司，批号：H21021909）；MMP9试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：E-ELR3021）；ALB试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：E-EL-R0362c）；TLR4抗体（GeneTex，批号：GTX64330）；NF-κB p65抗体（GeneTex，批号：GTX102090）；二抗：HRP标记的山羊抗兔（Servicebio，批号：GB23303）；组化试剂盒DAB显色剂（Servicebio，批号：G1211）。

1.8.3主要仪器

DK-8D电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）；Mili-Q Advantage A10超纯水制备仪（美国Milli Pore公司）；Centrifuge 5804R台式高速低温离心机（德国Eppendorf公司）；905立式超低温冰箱（美国Thermo公司）；JA2003N万分之一分析天平（上海佑科有限公司）；BT125D十万分之一分析天平（瑞士梅特勒托利公司）；DDY-6C垂直/水平电泳仪（北京市六一仪器厂）；Scientz-192高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.8.4造模制备及取材

大鼠适应性喂养10天后，按照体重随机分为空白组（11只）和造模组（23只）。造模组予腺嘌呤100 mg/kg加乙胺丁醇250 mg/kg灌胃。连续21天后两组各取5只腹主动脉取血，测定血尿酸水平。取肾组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制成切片，HE染色，观察肾脏组织。若空白组和造模组血尿酸水平差异具有统计学意义，并且造模组肾脏组织病理改变，提示造模成功。

将成模大鼠随机分为模型组、非布司他组、补肾活血方组3组，每组6只，剩余6只正常鼠作为空白组。补肾活血方组予补肾活血方绿色颗粒剂水溶液4 g/kg，阳性药物组予非布司他水溶液3.6 mg/kg，补肾活血方加非布司他组予补肾活血方颗粒剂4 g/kg加非布司他3.6 mg/kg混合水溶液，空白组和模型组予等量生理盐水灌胃。各组大鼠每日干预给药1次，灌胃体积为1 ml/100 g，连续干预4周。

于灌胃治疗第4周麻醉处死各组大鼠，腹主动脉取血，分离血清（4℃，3000 r min-1，10 min），送至河南中医药大学第一附属医院检验科测定大鼠血尿酸（SUA）、肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）等肾功能相关的生化指标，ELISA法检测大鼠血清MMP9和ALB水平。取右肾置于4%多聚甲醛中固定，左肾外缘纵切，将肾组织放入液氮中冷冻以备RT-PCR、WB方法检测。

1.8.5实时荧光定量PCR（PT-PCR）分析

使用RNA-easyTM Isolation Reagent试剂提取肾组织中总RNA，根据反转录试剂盒说明反转录合成cDNA，然后进行RT-PCR反应。反应条件:95℃预变性5 min 1个循环;循环反应95℃、10 s，60℃、30 s，共40个循环；溶解曲线95℃、15 s，60℃、1min，95℃、15 s。根据仪器自带软件计算出各孔cq值，通过内参GAPDH校正，利用公式2-ΔΔct计算各处理组相对的基因转录水平。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.8.6蛋白免疫印迹法（Western blot）分析

采用Western blot检测补肾活血方对TLR4和NFκB蛋白表达的影响。将肾组织研磨成匀浆，置于冰上裂解30 min。低温高速离心机中离心（12000 rpm）10 min，取上清，按照BCA试剂盒的步骤测定总蛋白浓度，每个样品分装成2管，标记后分别于-20℃和-80℃冰箱备用。聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，牛奶封闭，用PBST配制一抗稀释液（1∶1000），4℃孵育过夜，PBST洗3次；将NC膜置PBST配制的二抗（1∶10000）孵育2 h，PBST洗3次。曝光，用Image J软件对条带进行灰度分析。

1.8.7统计学方法

采用SPSS26.0软件进行统计分析，计量资料以xˉ±s表示，使用单因素方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 补肾活血方有效活性成分筛选

通过TCMSP检索得到补肾活血方中5味中药的113种活性成分，其中黄芪20种，丹参64种，菟丝子11种，莪术3种，大黄15种，有5种成分为2种中药所共有，见表2（仅列出黄芪、丹参、菟丝子、大黄前5种活性成分，莪术3种活性成分）。

2.2 筛选中药靶点和疾病共同靶点Venn图

检索筛选共得到UAN治疗靶点882个，与得到的1160个补肾活血方对应靶点取交集，共得到个234补肾活血方相关靶点作用于UAN的靶蛋白。利用在线韦恩图绘制工具（Venn diagrams）绘制靶蛋白韦恩图，见图1。

图1 交集靶点Venn图

2.3 “药物-活性成分-疾病-靶点”网络图的构建

将补肾活血方和疾病共同靶点导入Cytoscape3.9.0软件进行可视化处理。得到的网络共有1种疾病、5味中药、113个活性成分（包含5种共有成分，其中MOL000296为黄芪与莪术共有成分，MOL000422、MOL000098、MOL000354为黄芪与菟丝子共有成分，MOL000358为大黄与菟丝子共有成分，）、234个共同靶点。“中药-活性成分-疾病-靶点”网络图，见图2。

图2 中药-活性成分-靶点-疾病网络图

2.4 PPI网络拓扑分析及核心靶点的筛选

PPI网络图分析可知，初始PPI网络，共233个节点，4175条边；DC＞2倍DC中位数（54）PPI网络，共44个节点，777条边；最终筛选出的核心靶点PPI，共19个节点，171条边。其核心靶点分别为Toll样受体4（TLR4）；纤维连接蛋白基因(FN1)；信号传导和转录 激 活 因 子-3（STAT3）；白 蛋 白(ALB)；胱 冬 酶3（CASP3）；JUN基因(JUN)；丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)；前 列腺 素G/H合酶2（PTGS2）；FOS基 因（FOS）；MYC基因(MYC)；白细胞介素-8(CXCL8)；血管内皮生长因子A(VEGFA)；丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK)；SRC基因（RSC）；肿瘤坏死因子（TNF）；基质金属蛋白酶9(MMP9)；白细胞介素-1β（IL-1β）；TP53基因（TP53）；白细胞介素-6（IL-6)。提示得到的上述19个核心靶点可能是补肾活血方治疗UAN的关键靶点。PPI蛋白互作网络图，见图3。

图3 PPI网络构建及核心靶点的筛选过程图

2.5 补肾活血方核心靶点GO功能富集和KEGG通路富集

GO富集分析共得到基因功能信息925个。其中，基因功能信息生物过程（BP）富集了698个GO功能，主要参与炎症反应（inflammatory response），信号传导（signal trnsduction），氧 化 还 原 过 程（oxidationreduction process），细胞增殖（cell proliferation），调控凋 亡 过 程（regulation of apoptotic process），老 化（aging），对 脂 多 糖 的 反 应（response to lipopolysaccharide）等生物过程。细胞组成（CC）富集了71个GO功能，主要集中于细胞质膜（plasma membrane），细胞质（cytoplsm），细胞核（nucleus）中。分子功能（MF）富集了156个GO功能，主要参与蛋白质结合（protein binding），受体结合（receptor binding），酶 结 合（enzyme binding），蛋 白 激 酶 结 合（protein kinase binding）等，见图4。

图4 补肾活血方核心靶点GO富集分析

通过KEGG富集分析，共得到核心靶点参与的通路112条，主要包括NF-κB信号通路、PI3K-Akt信号通路、Toll样受体信号通路、Ras信号通路、NF-κB信号通路、p53信号通路等，见图5。此外，结果还显示补肾活血方活性成分的靶基因还涉及其他疾病，如肝炎、肿瘤、脂质和动脉粥样硬化、感染性疾病、内分泌疾病和免疫性疾病等，提示了补肾活血方治疗这些疾病的潜在优势。

图5 补肾活血方核心作用靶点KEGG通路富集分析

2.6 分子对接

由2.1可知，补肾活血方前6的活性化合物为MOL007064、MOL000398、MOL007132、MOL007140、MOL000471、MOL000940，将其与核心靶点进行分子对接，分子对接结合能打分及对接参数，见表3。一般认为，结合能越低说明分子对接越稳定，结合能小于0说明结合具有一定的活性，结合能小于负7说明结合活性较好，结合能小于负9说明结合活性非常强[23-26]。根据结合能，分别取小分子MOL000940与大分子蛋白ALB、MMP9、TLR4（结 合 能 分 别 为：-9.9、-9.8、-8.0 kcal·mol-1）、小分子MOL000398与大分子蛋白MMP9（结合能为：-10.1 kcal·mol-1）进行分子对接，由表2可知MOL000940、MOL000398所对应的分子活性分别为双脱甲氧基姜黄素（bisdemethoxycurcumin）、异黄酮（isoflavanone）。将分子对接结果进行可视化处理，见图6。

图6 补肾活血方核心化合物治疗UAN的4个核心靶点的对接结果

表3 关键化合物与核心靶点分子对接结合能打分及对接参数

2.7 补肾活血方对大鼠肾功能的影响

大鼠肾功能结果显示，与对空白组相比，模型组大鼠SUA、Scr明显上升（P＜0.01，P＜0.05）。与模型组相比，各给药组SUA均明显下降（P＜0.01），补肾活血方组Scr明显下降（P＜0.01），见表4。

表4 补肾活血方对大鼠肾功能的影响

2.8 补肾活血方对大鼠血清MMP-9和ALB的影响

Elisa结果显示，与空白组比较，模型组MMP-9明显上升（P＜0.01），ALB均明显下降（P＜0.05）。与模型组相比，补肾活血方组和非布司他组MMP-9均明显下降（P＜0.05，P＜0.01）；各给药组ALB均明显上升（P＜0.01），见表5。

表5 补肾活血方对大鼠血清MMP-9和ALB的影响

2.9 补肾活血方对大鼠肾脏TLR4、NF-κB蛋白表达水平的影响

定量PCR结果显示，与空白组相比，模型组TLR4、NF-κB mRNA在肾组织中的表达水平明显上升（P＜0.01），补肾活血方组NF-κB mRNA在肾组织中表达上升（P＜0.05）；与模型组相比，非布司他组和补肾活血方组TLR4 mRNA在肾组织中的表达水平明显下降（P＜0.01），差异具有统计学意义，见表6。Western blot结果与定量PCR结果趋势一样，两个靶基因在大鼠肾脏的蛋白表达水平与mRNA水平变化趋势一致，见表7、图7。

表6 补肾活血方对大鼠肾组织TLR4、NF-κB mRNA表达水平的影响（xˉ±s，n＝3）

表7 补肾活血方对大鼠肾组织TLR4、NF-κB蛋白表达水平的影响（xˉ±s，n＝3）

图7 各组大鼠肾TLR4、NF-κB蛋白表达电泳

3 讨论

近年高尿酸被认为是慢性肾脏病（CKD）发生发展的独立危险因素,持续的高尿酸状态促使肾脏微血管及小动脉发生病变，致使肾小管间质炎症和纤维化形成[27-28]。随着肾脏损伤过程的延长，损伤部位会出现明显的肾间质纤维化的病理改变，并最终走向肾衰竭，导致不可逆的肾脏结构改变[29]。因此，早期干预尿酸性肾病，减少肾损伤，是治疗UAN必不可少的步骤。

3.1 补肾活血方成分分析

通过中药-成分-疾病-靶点网络，共筛选得到双脱甲氧基姜黄素、异黄酮、槲皮素、异鼠李素等113种治疗UAN的潜在活性成分。有研究证明[30-32]，双脱甲氧基姜黄素、异黄醇、异鼠李素能够减轻炎症反应，进而达到治疗UNA的作用。双脱甲氧基姜黄素能够抑制MAPK和NF-κB信号通路的活化，进而发挥抗炎作用。槲皮素具有抗氧化应激和保护肾脏的作用，可以有效抑制黄嘌呤氧化还原酶活性，进而抑制黄嘌呤转化为尿酸，达到降低尿酸的作用，还可通过抑制TGFβ积累来保护肾组织，延缓肾脏纤维化进程[33-35]。槲皮素的代谢产物异鼠李素具有抗炎、抗细胞凋亡的作用，能够调节NF-κB、PI3K/Akt、MAPK通路，减少NFκB、TNF-α、IL-1及IL-6等因子的表达，保护肾脏[32,36]。以上研究提示，补肾活血方可通过此次筛选的双脱甲氧基姜黄素、异黄酮、槲皮素、异鼠李素等有效成分通过NF-κB、PI3K/Akt、MAPK等信号通路作用于NFκB、TNF-α、IL-1、IL-6及TGF-β等多个靶点来发挥抗炎、抗氧化、调节细胞凋亡等作用，达到治疗UAN的目的。

3.2 补肾活血方主要靶点分析

GO富集分析结果表示，补肾活血方可能通过炎症反应、氧化还原过程、对细胞增殖、凋亡和老化等途径治疗UNA。通过PPI网络拓扑分析后最终筛选预测到TLR4、MMP9、ALB、FN1、STAT3、CASP3、JUN、PTGS2、MAPK8、FOS、CXCL8、VEGFA、MAPK、RSC、TNF、IL-1β、TP53、IL-6等19个核心靶点。基质金属白酶MMP9主要具有维持和降解细胞外基质的作用，可参与巨噬细胞的炎症反应，在肾脏相关疾病炎症反应中活性明显增加，可导致肾小球基底膜的破坏，其含量与肾损伤呈正相关[37-41]。TLR4是参与机体非特异性免疫过程的重要蛋白质，可通过上调IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子，而诱导炎症反应，导致肾脏损伤[42-44]。根据以上研究可推测，靶点MMP9、TLR4可能为治疗UAN的关键核心靶点，可作为防治UAN的靶向分子机制进一步的深入研究。根据分子对接结合能打分及对接参数推测补肾活血方治疗UAN的关键靶点还可能涉及ALB靶点。

3.3 补肾活血方主要通路分析

KEGG富集分析表示，PPI的核心靶点主要通过NF-κB信号通路、TLR4信号通路、PI3K-Akt信号通路、cAMP信号通路、TNF信号通路等信号通路。高建东等[45]研究表明，降糖方通过降低TLR4/NFκB信号通路的活化水平，抑制TNF-α、IL-6等炎症因子的生成，减少尿酸盐结晶，减轻尿酸引起的肾脏炎症。PI3K-Akt信号通路可调控mTOR激酶，发挥调解多数慢性纤维化性疾病的作用[46]。韩亚琼等[47]研究表明，红景天可能通过抑制cAMP/PKA/CREB信号通路，降低IL-1β、IL-6、TNF-α等含量，增加cAMP含量，进而抑制大鼠的炎症反应和细胞的凋亡。由以上研究可知，补肾活血方可能通过抑制NF-κB、TLR4、PI3K-Akt、TNF等信号通路来减轻炎症反应，延缓肾脏纤维化，发挥保护肾脏的作用。

3.4 分子对接及实验验证分析

分子对接结果表明，ALB与双脱甲氧基姜黄素，MMP9与双脱甲氧基姜黄素、异黄酮对接构图，TLR4与双脱甲氧基姜黄素的对接结合能均＜-7 kcal·mol-1，提示筛选出的活性成分与核心靶点具有较好的结合活性。基础实验结果显示，补肾活血方可以降低UAN模型大鼠肾组织中TLR4和NF-κB基因及蛋白表达水平，降低血清MMP-9水平，增加ALB含量，提示补肾活血方减轻肾脏病理损伤的作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB炎性通路有关，进而发挥肾脏保护作用。

综上所述，通过网络药理学提示，补肾活血方通过多成分，多靶点，调节多通路的特点治疗UAN，其在炎症反应、氧化还原反应、细胞的增殖与凋亡等生物过程方面发挥作用。分子对接证实补肾活血方的有效成分与疾病关键核心靶点对接良好，动物实验证实补肾活血方能够降低UAN模型大鼠肾组织中TLR4和NF-κB基因及蛋白表达水平，可通过抑制NLRP3/NF-κB信号途径，抑制炎症反应，降低MMP-9水平，发挥保护肾脏作用，减少ALB漏出，增加ALB含量，但UAN发病机制复杂，且实验仍有不足，本实验样本量较小，未对网络药理学预测的关键靶点进行更完善的验证，根据网络药理学和分子对接结果可为后续深入进行机制研究提供科学的理论依据。