双重实时荧光PCR快速鉴别人参和西洋参＊

孙 涛，周 林，滕少娜，何 玲，陈亭旭，任风鸣，潘英文，孔德英＊＊

（1.重庆海关技术中心 重庆 400020；2.国家中药材物种鉴定及质量安全检测重点实验室 重庆 400020；3.重庆市药物种植研究所 特色生物资源研究与利用川渝共建重点实验室 重庆 408435；4.海口海关热带植物隔离检疫中心 海口 570311）

人参（Panax ginseng）和西洋参（P.quinquefolium）是五加科人参属中药用价值很高的药材。人参具有大补元气，补脾益肺，生津养血，安神益智等功效；西洋参能清心安神，养阴润肺，用于阴虚燥咳，劳嗽咳血，虚烦痉挛，失眠多梦，精神恍惚等[1]。因此，人参和西洋参是备受追捧的名贵滋补良药，强根固本佳品。但是，目前人参、西洋参市场除正品外，尚有较多的代用品、伪品、混淆品，一些市售药品、饮片不含标签明示的人参、西洋参成分，给中药材市场管理带来极为不利的影响，因此有必要开展人参、西洋参成分及真假鉴别技术研究。同时，随着国内外对于中药材的广泛认可，人参、西洋参等药材使用量和采挖量日益加大，开展人参与西洋参的鉴别技术研究，对其进行资源保护和安全合理利用具有重要意义。

有关人参和西洋参传统的鉴定方法，主要是性状鉴别，即通过眼观、鼻闻、口尝、手摸等手段来对药物的形状、大小、颜色、表面特征、断面、气味等进行鉴别和描述。但由于这些性状特征常受到外界环境的影响，需要经验丰富的专业人员才能进行准确的鉴别，并且随着制成中成药后，性状鉴别难度会进一步增加。现代生物技术的发展为人参属药用植物的鉴定提供了新的方法。从1994年随机引物PCR（randomly primed PCR,AP-PCR）首次用于人参、西洋参的鉴别以来[2]，DNA分子标记技术应用于中药材鉴别已有不少的报道，包括SCAR[3]、AFLP[4]、PCR-RFLP[5-6]、条形码鉴定技术[7-9]、RAPD[10]、Bar-HRM[11]等现代分子生物学鉴定手段得到广泛应用，并逐步随着DNA分子水平的遗传分析发展而达到鉴别标准化[12]。在众多的分子生物学方法中，实时荧光PCR方法因具有准确、快捷、灵敏的特点，而被应用于人参和西洋参的快速鉴别上[13-15]。但是，目前还未有针对人参和西洋参的单管同时鉴别的实时荧光PCR检测的研究报道。运用多重实时荧光PCR方法能在同一反应中同时对多个靶基因进行检测，可以减少操作步骤，缩短检测时间，降低检测成本。本研究旨在建立一种能同时鉴别人参和西洋参的双重实时荧光PCR方法，以期为人参、西洋参的快速鉴别提供新的解决方案。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料

供试样品包括7个人参样品、6个西洋参样品以及其他10个样品，共计12种23个样品（表1）。样品经国家中药材物种鉴定及质量安全检测重点实验室（重庆）孔德英正高级农艺师鉴定，保存于重庆海关技术中心。

表1 试验材料信息

1.2 试剂与仪器

磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒购自珠海宝瑞生物公司；Premix Taq® Version 2.0、Premix Ex Taq（Probe qPCR）购自宝生物（大连）有限公司。引物探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

球磨仪为德国莱驰的MM400，全自动核酸提取仪为赛默飞世尔的Kingfisher Duoprime，超微量核酸蛋白检测仪为赛默飞的NanoDrop one，实时荧光PCR仪为美国ABI stepone plus。

2 方法

2.1 DNA提取

用75%酒精对样品进行擦洗，清水冲洗晾干后用球磨仪将样品研磨成粉。随后按照磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒说明书方法进行样品DNA提取，提取的DNA用Nanodrop One超微量核酸蛋白检测仪测定核酸质量和浓度，保存于-20℃冰箱备用。

2.2 引物设计

比对分析人参属物种及近似种的常用备选条码基因及18S基因序列，根据人参在18S基因序列中497和501 bp处与其他物种的差异（图1），利用Primer Express3.0软件设计特异性引物探针，引物为Pgf（5'-CACGGGGAGGTAGTGACAATA-3'）/Pgr（5'-AGACTT GCCCTCCAATGGAT 3'），探针为Pgp（FAM-CGGGCTG ATTCAGTCT-MGB）。西洋参引物探针在黄永辉等[14]基础上，对探针做适当调整，引物为Pqf（5'-AGTTGCGCCCGAAGCC ATTA-3'）/Pqr（5'-AGACACG GGAGGCCATTATC-3'），探针为Pqp（VIC-ATCACTCC TTTGC GGGAGTCGA-BHQ1）。

图1 人参与其近似种的18S序列比对图

2.3 单重实时荧光PCR

以7个人参样品、6个西洋参样品及其他10个样品，共计23个样品DNA为模板，进行引物验证。PCR反应体系为20 µL，包括10 µL 2×荧光PCR反应预混液，上下游引物各0.5 µL（10 µmol/L），探针0.5 µL（10 µmol/L），DNA模板2 µL，灭菌去离子水补至20 µL。实时荧光PCR反应程序为：95℃预变性30 s；然后以95℃5 s，60℃30 s进行40个循环。每个循环中60℃30 s结束时设置荧光通道采集荧光信号。

2.4 双重实时荧光PCR

应用矩阵法对引物和探针进行最佳配比和筛选，最终PCR反应体系为20 µL，包括10 µL 2×荧光PCR反应预混液，人参引物Pfg、Prg各0.5µL（10µmol/L），西洋参引物Pfq、Prq各0.3µL（10µmol/L），探针Prog、Proq各0.4 µL（10 µmol/L），DNA模板2 µL，灭菌去离子水补至20 µL。实时荧光PCR反应程序为：95℃预变性30 s；然后以95℃5 s，60℃30 s进行40个循环。每个循环中60℃30 s结束时设置荧光通道检测荧光信号。

2.5 特异性测试

为了验证该方法是否能够同时检出人参与西洋参，在样品研磨成粉后，取重量相当的人参粉与西洋参粉进行混合，提取混合样品的DNA做模板进行检测。共制备4份人参西洋参混合样品DNA进行检测，4份混合样品分别为人参PG-01混西洋参PQ-01、人参PG-02混西洋参PQ-02、人参PG-03混西洋参PQ-03、人参PG-04混西洋参PQ-04。以7个人参样品、6个西洋参样品、10个其他样品以及4个混合样品共计27份样品DNA为模板，评价本试验所建立方法的特异性。

2.6 灵敏度测试

将人参样品PG-02及西洋参样品PQ-05的DNA测定核酸浓度后分别稀释至200 ng/µL，然后等体积混合（混合后，人参及西洋参DNA浓度均为100 ng/µL）,将该混合样品进行10倍梯度稀释，稀释成8个浓度梯度，然后按照2.4中的方法进行实时荧光PCR扩增测试该方法对人参及西洋参的检测灵敏度，并根据CT值绘制标准曲线。

3 结果

3.1 引物探针验证

利用设计的人参引物探针对23份样品的DNA进行验证，结果显示7个人参DNA样品均出现特异扩增曲线，其他非人参样品及空白对照均无特异性扩增（图2），表明该引物探针用于人参检测具有良好的特异性。

图2 人参实时荧光PCR特异性扩增图谱

利用引用的西洋参引物探针对23份样品的DNA进行验证，结果显示6个西洋参DNA样品均出现特异扩增曲线，其他非西洋参样品及空白对照均无特异性扩增（图3），表明该引物探针用于西洋参检测具有良好的特异性。

图3 西洋参引物探针实时荧光PCR特异性扩增图谱

3.2 双重荧光定量PCR探针特异性

应用本实验建立的方法对7个人参样品、6个西洋参样品、10个其它样品及4个人参西洋参混合样品共计27个样品的DNA进行检测，结果表明7个人参样品及6个西洋参样品均出现单条典型扩增曲线（图4，图5），4个人参西洋参混合样品均出现双条典型扩增曲线（图6），而供试的其他10份样品DNA及空白对照均无扩增曲线（图6），说明该引物与探针用于人参与西洋参检测具有良好的特异性，所建立的双重荧光定量PCR方法具有较好的可靠性。注：27份DNA样品检测为同一实验进行，为便于结果观察，将人参、西洋参及剩余其它处理分别做图。

图4 人参样品双重荧光定量PCR特异性扩增图谱

图5 西洋参样品双重荧光定量PCR特异性扩增图谱

图6 人参西洋参混合样品及其它样品双重荧光定量PCR特异性扩增图谱

3.3 灵敏度测试

将人参样品PG-02及西洋参样品PQ-05的DNA测定核酸浓度后分别稀释至200 ng/µL，然后等体积混合（混合后，人参及西洋参DNA浓度均为100 ng/µL），将该混合样品进行10倍梯度稀释，稀释成8个浓度梯度，稀释后人参及西洋参DNA浓度均为1×105pg/µL至1×10-2pg/µL，取2 µL作为模板用于灵敏度检测。结果表明人参DNA浓度在1×105pg/µL至1×10-0pg/µL时，均能得到典型的扩增曲线（图7），西洋参DNA浓度在1×105pg/µL至1×100pg/µL时，能够得到典型的扩增曲线（图8）。

图7 双重荧光定量PCR检测人参的扩增图谱

图8 双重荧光定量PCR检测西洋参的扩增图谱

人参样品DNA浓度从1×105pg/µL至1×100pg/µL对应的CT值分别为16.58、20.39、24.62、28.36、32.34、34.89，以扩增曲线的CT值为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制标准曲线（图9），所得线性方程为y=-3.567x+38.557，R2=0.993，扩增效率=90.685%，最低检测限是2 pg DNA/反应。

图9 双重荧光定量PCR检测人参的标准曲线

西洋参样品DNA浓度从1×105pg/µL至1×100pg/µL对应的CT值分别为17.73、21.25、24.71、28.61、32.19、35.64，以扩增曲线的CT值为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制标准曲线（图10），所得线性方程为y=-3.59x+42.83，R2=0.998，扩增效率=89.901%，最低检测限是2 pg DNA/反应。

图10 双重荧光定量PCR检测西洋参标准曲线

4 讨论

基于高通量、易操作、易观察等诸多优点，多重实时荧光PCR技术已广泛应用于人类疾病检测、动植物物种及病原微生物鉴定、转基因检测等领域[16-19]。在中药材的鉴定方面多重实时荧光PCR技术也有较广泛的研究。张全芳等[20]利用多重实时荧光PCR方法来鉴定南柴胡和北柴胡，刘艳艳等[21]将多重实时荧光PCR法应用于药用贝母属系统发育关系分析及检测等。但，关于人参与西洋参的多重实时荧光PCR方面的研究还未见报道。

本研究首先比对分析了人参属物种常用条形码基因，根据人参在18S基因（Genebank登录号：KC593817.1）序列中497和501 bp处与其他物种的差异设计人参特异性引物探针（图1），西洋参引物探针在黄永辉等[14]基础上，对探针做适当调整，将发光基团改为VIC。随后对两种引物进行验证，结果发现设计的人参引物探针可以从23份样品中准确地识别出7份人参样品（图2），西洋参引物探针能够从23份样品中准确地识别出6份西洋参样品（图3）。随后应用矩阵法对引物和探针进行最佳配比筛选，建立了人参与西洋参双重实时荧光PCR方法，运用本方法对27份DNA样品进行检测，结果显示7个人参样品及6个西洋参样品均出现单条典型扩增曲线，4个人参西洋参混合样品均出现双条典型扩增曲线，而供试的其他10份DNA样品及空白对照均无扩增曲线（图4、图5、图6），表明该方法具有良好的特异性。最后灵敏度测试结果显示，建立的双重实时荧光PCR方法检测人参与西洋参的最低检测限均达到2 pg DNA/反应，表明该方法具有较高的灵敏度。人参与西洋参样品在双重实时荧光PCR反应中扩增曲线的ΔRn峰值较单重实时荧光PCR反应中扩增曲线的ΔRn峰值有明显降低，从单重PCR实验的100000左右（图2）及70000左右（图3）下降到双重PCR实验的40000左右（图4、图5），这可能和引物探针添加量降低以及引物探针互相干扰有关。但在比较人参与西洋参样品在单重实时荧光PCR以及双重实时荧光PCR实验中前后的CT值可以看出，差异并不大，说明这种干扰对CT值的影响较小。

人参、西洋参的快速鉴别已有较多研究。刘丽等[22]建立了能同时鉴别人参、西洋参及三七的多重普通PCR方法，只存在150 bp条带的为人参、只存在400 bp带为三七，同时存在150 bp和400 bp条带为西洋参，但该方法无法用于混合样品的区分，同时该方法的灵敏度在10 ng DNA/反应。实时荧光PCR法灵敏度高，可用于微量甚至痕量检测[23]，本研究针对人参、西洋参设计特异性引物探针，将人参与西洋参的探针标记上不同的发光基团（人参探针标记FAM发光基团，西洋参探针标记VIC发光基团），当在FAM信号通道检测到荧光信号时即判定样品为人参，在VIC信号通道检测到荧光信号时即判定为西洋参，在两个信号通道同时检测到荧光信号时即判定为人参西洋参混品，从而实现对人参、西洋参的同时检测，可用于人参与西洋参混合样品的检测。同时，所建立的双重实时荧光PCR法检测人参与西洋参方法灵敏度均达到2 pg DNA/反应，灵敏度也有较大的提升。

本研究针对人参和西洋参的特异性基因序列，建立了一种灵敏度高，准确性好的双重实时荧光PCR方法，可在单一反应管内同时完成对人参和西洋参的检测。运用单一的人参DNA、西洋参DNA样品，混合的人参与西洋参DNA样品及其他物种的DNA样品对该方法进行多维度的特异性评价，结果显示该方法具有良好的特异性。而且，灵敏度测试显示该方法检测人参与西洋参的最低检测限均可达到2 pg DNA/反应。总之，本研究首次建立了人参西洋参双重实时荧光PCR检测方法，该研究降低了检测成本，提高了检测效率，可应用于人参、西洋参成分的快速检测，可辨别样品中是否含有相应成分，在药品真伪鉴别领域具有一定的应用前景。