马尔堡病治疗和预防研究进展①

王歆玮 张妤亭 郑源强 石艳春 陈国江（内蒙古医科大学内蒙古自治区分子生物学重点实验室，呼和浩特 010058）

马尔堡病毒（Marburg virus，MARV）是人类马尔堡病（Marburg disease，MARD）的病原体，病死率23%～90%［1-2］。MARV是丝状病毒科（Filoviridae）的一员，丝状病毒科主要由马尔堡病毒属（Marburgvirus）、埃博拉病毒属（Ebolavirus）组成［2-3］。马尔堡病毒属包括马尔堡病毒（Marburg virus，MARV）和拉文病毒（Ravn virus，RAVV）两个亚型［4-5］，MARV 主要有Angola、Musoke 和Ci67 等分离株［6］。最近的一次马尔堡病毒疫情发生在2021 年8 月，几内亚东南部发现了马尔堡出血热确诊的死亡病例。

MARV 具有非分段负义RNA 基因组，编码7 种结构蛋白，从3'至5'依次为核衣壳蛋白（nucleoprotein，NP）、病毒蛋白（viral protein，VP）VP35、VP40、糖蛋白（glycoprotein，GP）、VP30、VP24 以及RNA 依赖的RNA 聚合酶L［7］。其中GP 蛋白作为MARV 唯一表面蛋白，能介导病毒与靶细胞的黏附以及病毒的进入［8］。MARV 糖蛋白基因包含一个编码全长GP 的开放阅读框（open reading frame，ORF），在内质网中合成后，前体GP 被反式高尔基体网络中的Furin 蛋白酶在435 位氨基酸位点处水解切割，产生两个二硫键连接的亚基，GP1和GP2［9］。由GP1形成的胞外结构域介导与受体的结合，而GP2 上含有融合肽，能介导病毒与细胞膜的融合［8］。MARV 通常通过直接接触受感染者的血液或其他体液（唾液、尿液、汗液等）而透过损伤皮肤或黏膜进入人体［10］。单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等抗原提呈细胞是MARV 感染的早期目标［11］，这些被感染的细胞通过淋巴液或血液将病毒传播至周围淋巴结、肝脏和脾脏等富含单核/巨噬细胞的多个组织和器官进行复制［12-13］，促使受感染的单核/巨噬细胞释放大量促炎细胞因子（IL-6、IL-8、IL-15 和IL-16）、趋化因子和生长因子（巨噬细胞炎症蛋白MIP-1、单核细胞集落刺激因子、M-CSF、单核细胞趋化蛋白MCP-1）从而诱发全身炎症反应［14］。同时病毒本身会抑制人体Ⅰ型干扰素的分泌，而干扰素是机体抗病毒感染免疫的主要效应分子。在病毒感染晚期，血管内皮细胞是MARV 感染的主要靶细胞，内皮细胞通透性增加和毛细血管受损可能与MARV 在内皮细胞中的复制有关［13，15］，这也是马尔堡病毒病发生出血症状的主要原因。此外，淋巴细胞虽不是MARV 感染的主要目标，但在感染者的淋巴组织中，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TNF related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）和一氧化氮（NO）的表达增加，改变淋巴细胞生存微环境，导致淋巴细胞和自然杀伤细胞大量凋亡［14］。

MARV 既是一种自然获得性疾病，也是生化武器的潜在病原体，对全球健康构成严重威胁，马尔堡病毒病的防治研究举足轻重。MARV GP 的受体结合域（receptor binding domain，RBD）定位于GP1的38～188位氨基酸［16］，其中MARV 进入的一个重要步骤是内体蛋白酶水解GP1，促进受体结合域与内体进入因子Niemann-Pick C1（NPC1）蛋白的结合［8］。MARV 包膜糖蛋白GP 作为主要抗原，其RBD 区既为疫苗设计常用的序列，也是抗体识别的主要位点［17］。本文总结了MARD 潜在的预防与治疗措施，包括疫苗、单克隆抗体、小分子药物和小干扰RNA（siRNA）等。

1 马尔堡病的预防性疫苗

自从MARV 被首次发现以来，科学家们就一直致力于MARV 等丝状病毒的疫苗研究，但至今在世界范围内都没有获得批准任何针对MARV 的疫苗。目前有三种候选马尔堡疫苗（cAd3、MVA-BN-Filo和MARV DNA）正处于1 期临床试验。多个MARV 疫苗（腺病毒、DNA、rVSV、VLP）已在非人类灵长类动物（nonhuman primates，nHPs）中显示出保护作用［18］。

1.1 腺病毒载体疫苗 现针对埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）已有几种腺病毒疫苗，但针对MARV的腺病毒疫苗有限。重组腺病毒5 血清型（recom⁃binant adenovirus serotype 5，rAd5）是糖蛋白GP 疫苗最常用的载体。在一项研究中，给猕猴注射单剂量表达MARV-Angola GP 的rAd5 疫苗，4 周后给予同种MARV 攻击，均未出现临床症状，表明该疫苗对nHPs提供完全保护性免疫［19］。

复合腺病毒（the complex adenovirus，CAdVax）疫苗平台使用5 种抗原：EBOV、SUDV、MARV（Musoke和Ci67）和RAVV的GP以及EBOV和MARVMusoke 的NP。研究人员采用初免-加强免疫策略（prime-boost strategy）对猕猴进行这种疫苗接种，并用EBOV、SUDV 和MARV-Musoke/Ci67株进行攻击，它们产生了针对以上5 种丝状病毒的抗体，所有动物均未出现临床疾病［20］。

但是，腺病毒载体疫苗的使用受到人群中预存免疫（preexisting immunity）的限制，为了解决这一问题，研究人员尝试采用不太常见的血清型，并在动物模型中进行了口服或鼻腔疫苗接种。科学家们使用黑猩猩腺病毒3 型（chimpanzee Adenovirus 3，cAd3）载体及EBOV GP 制备疫苗，针对EBOV 攻击显示100%的保护作用［21］。cAd3 马尔堡疫苗的1 期临床试验目前正在进行。

2016 年发表的MVA-BN-Filo 疫苗1 期临床试验采用与复合腺病毒疫苗相同的免疫策略，参与者没有产生疫苗相关的严重不良反应，并且所有接种者在接种增强疫苗后第21 天和8 个月均可检测到IgG水平［22］。

1.2 DNA 疫苗 丝状病毒的DNA 疫苗在nHPs 试验中具有良好的安全性，且易于生产，能诱导产生特异性免疫应答；但在临床试验中，这些疫苗的免疫原性有限［23-25］。将含有MARV-Musoke GP 和MARV-Angola GP 的DNA 疫苗在食蟹猴身上进行试验，产生IgG 反应并保护其免受同种病毒攻击，但是，所有动物都出现临床症状，这表明仅有IgG 反应不能控制感染［19，26］。但将DNA 疫苗作为初免-加强免疫策略的一部分，先使用DNA 疫苗初次免疫，再用腺病毒载体疫苗加强免疫，能够完全保护实验动物。表 达MARV-Angola GP 的DNA 疫 苗（VRC⁃MARDNA025-00-VP）已完成1期临床试验。

1.3 重组水疱性口炎病毒（recombinant vesicular stomatitis virus，rVSV）载体疫苗 MARV rVSV 疫苗是一种重组的、具有复制能力的水疱性口炎病毒候选疫苗，将水疱性口炎病毒外膜糖蛋白基因替换为马尔堡病毒糖蛋白基因，目前有几种rVSV疫苗已经在nHPs 中进行研究［27］。用含有MARV、EBOV 和SUDV 3 种GP 的rVSV 载体疫苗免疫nHPs 后，所有3 种组分均能产生抗体免疫应答，且对MARV、EBOV、SUDV 和TAFV 均有100%的交叉保护作用，其中一只动物出现了可检测到的病毒血症［28］。另一项研究表明，在接种rVSV-MARV-GP疫苗14个月后仍可检测到抗MARV GP 的IgG，且对MARV 的攻击显现出有效保护作用，这一结果也证明了rVSV载体疫苗的持久性［29］。rVSV 载体疫苗对于MARV 来说很有前景，目前还没有进行临床试验。

1.4 病毒样颗粒（virus-like particles，VLP）疫苗马尔堡VLP（MVLP）疫苗是基于MARV VP40 和GP制备的一种亚单位疫苗，产生的VLPs在形态上类似于Marburg 病毒粒子［30］。MARV-Musoke、Ci67 和RAVV 分离株的VLP 疫苗在nHPs 中进行了试验，其对所有3种毒株均可产生抗体反应，4周后用MARV攻击时，所有动物都表现出交叉保护作用［31］。

2 马尔堡病的治疗

目前多种抗马尔堡病毒的药物正在研发中，包括治疗性疫苗、抗体疗法、小分子药物、脂质包裹的siRNA等。

2.1 治疗性疫苗 以预防为目的的MARV 疫苗品类很多，但以感染病毒后的患者为治疗对象的MARV 疫苗主要是以rVSV 为载体的疫苗。研究表明，一种表达MARV-Musoke GP 的rVSV 疫苗（rVSV ΔG/MARV-Musoke-GP）可充分保护恒河猴免受高剂量MARV-Musoke的致命攻击。暴露后注射该疫苗，30 min 存活率为100%，24 h 存活率为83%，48 h 存活率为33%［32-33］。为了评估暴露后对最具致病性的MARV-Angola 突变株的疗效，研究人员设计了表达同源的MARV-Angola GP 的rVSV 疫苗。猕猴受到高剂量（1 000 PFU）或低剂量（50 PFU）Angola 突变株的攻击，并在暴露后20～30 min 接受治疗。在高剂量和低剂量的攻击下，分别有25%和60%～75%的治疗猕猴幸存下来［34］，这也表明病毒载量与存活率相关。而在MARD 没有其他有效治疗的情况下，暴露后疫苗应该是保护实验室和医护人员免受感染的极佳选择。

2.2 抗体疗法 有研究表明，从一例MARV 幸存者的B 细胞中成功分离的一株中和性单克隆抗体，其识别区域为MARV GP1 上的NPC1 蛋白受体结合域，这提示了该抗体的主要机制可能是抑制GP1 与NPC1受体的结合［35］。

2.2.1 多克隆浓缩IgG 从MARV 攻击中存活下来的nHPs 中分离浓缩的多克隆IgG，给MARV 攻击后的恒河猴注射3 剂（100 mg/kg），可提供完全保护作用，无病毒血症或临床疾病，但动物产生了IgM 反应，77 d 后再次用MARV 攻击显示出完全保护。另一研究中，MARV攻击后48 h静脉注射给药，随后在第4 天和第8 天给药，存活率100%，其中一只患上轻微疾病［36］。

2.2.2 单克隆抗体 几种单克隆抗体（monoclonal antibodies，mAbs）在小鼠感染模型展示了对MARV致死性攻击的保护作用。在恒河猴暴露于MARV后第4 天和第7 天分别给予静脉注射50 mg/kg 的人类单克隆抗体MR191-N，存活率100%。另一实验表明该mAb 针对MARV 的攻击存活率80%，针对RAVV 的存活率100%。接受治疗的动物其异常的实验室指标均有所改善，这使得mAb MR191-N成为治疗和预防MARV 的潜在候选药物。目前人体试验尚未开展［37］。

2.3 小分子药物

2.3.1 加利司韦（Galidesivir，BCX4430）BCX4430由美国BioCryst 制药公司研发，为人工合成的腺苷类似物，通过一种非专一性RNA 链终止子来抑制病毒RNA 聚合酶功能，进而导致病毒所需蛋白不能表达，该药属于广谱抗病毒药，其作用机制是阻断RNA 基因组的复制，抑制病毒繁殖［38］。实验显示BCX4430 可以抑制MARV 在体外培养的人类细胞中复制，此外，在MARV 攻击食蟹猴后1 h、24 h 和48 h，肌注BCX4430（15 mg/kg）2次/d，1 h组存活率83%；24 h 和48 h 组存活率100%，接受治疗的动物均未发现明显的病毒感染症状，实验室检查指标均有所改善，而对照组全部死亡。该药物的1 期临床研究已于2016年结束，目前结果尚未发表［39］。

2.3.2 法匹拉韦（Favipiravir，T-705）T-705 由日本富山化工制药公司研发，是一种新型的RNA 聚合酶抑制剂，主要通过阻断病毒核酸复制的方式来抑制病毒繁殖，该药对多种RNA 病毒具有广谱抗病毒活性，已在日本被批准用于治疗流感。已有研究表明，T-705 在小鼠模型中展示了对抗EBOV 的疗效［40］。BIXLER 等［41］证明，从食蟹猴接受MARVAngola（1 000 PFU）攻击当天开始，每日两次静脉注射T-705，持续14 d，存活率83%；但口服给药没有任何疗效。

2.3.3 瑞德西韦（Remdesivir，GS-5734）GS-5734由美国吉利德科技公司研发，是一种腺苷类似物的前体药物，具有体外抗MARV 活性。PORTER 等［42］已证明猕猴在感染MARV 后4～5 d 内，每日一次服用瑞德西韦5 mg/kg 或10 mg/kg，持续12 d，低剂量组存活率为50%，高剂量组存活率83%，证明该药对感染MARV 的猕猴有效，且存在剂量依赖性。该药已被成功用于治疗nHPs 中的埃博拉病毒病（Ebola virus disease，EVD），曾在患埃博拉病的护士及婴儿身上使用，证实可以提供保护作用［43-44］。

2.3.4 干扰素β（IFN-β）人类的EVD 与干扰素α的产生有关，患者血浆IFN-α 浓度远远超过其他病毒感染者（60～100 倍），但很少产生干扰素β。这一发现推进了在猕猴感染MARV 后注射IFN-β 的研究。早期用IFN-β 治疗显著延长了MARV 感染后的存活时间，但不影响病死率。根据现有的数据IFN-β 作为抗MARV 感染的单药疗法似乎前景不大，但有望作为MARV感染后的辅助治疗［45］。

2.3.5 带正电荷的磷酸二酯吗啉基低聚物（phos⁃phorodiamidate morpholino oligomers，PMOs）PMOs是一类寡核苷酸类似物，通过空间位阻抑制mRNA翻译，从而抑制病毒复制。发挥作用时，RNA 中的核糖碱基被结构类似的吗啉基替代，亚甲基磷酸二酯键与mRNA 结合，进而阻止mRNA 翻译，同时PMOs 添加哌嗪残基提供一个正电荷，可以增强与带负电荷的mRNA的亲和力［38］。

研究人员制备了一种组合型PMOs 药物AVI-6003，其为AVI-7287（靶向VP24 mRNA）与AVI-7288（靶向NP mRNA）的1∶1混合药物，在MARV-Musoke株感染的恒河猴中，给药AVI-6003显示出完全保护作用。在一项nHPs 的研究中，暴露后30～60 min 内给予AVI-6003 10 mg/kg 时存活率50%，20 mg/kg 和30 mg/kg 具有100%的保护作用。但随后的一项研究表明，AVI-7287 没有观察到生存益处或病毒滴度降低，而AVI-7288 具有抗病毒活性，其抑制NP 的合成，从而对病毒mRNA 的产生、病毒基因组复制和病毒组装产生影响［46］。在食蟹猴感染模型中，分别在病毒攻击后24 h、48 h 和96 h 开始，每日给药15 mg/kg，持续14 d，保护效率依次为83%、100%和83%［47-48］。

在一项人体随机对照试验中，AVI-6003 在人体内以递增剂量（0.05～4.5 mg/kg）给药，30 名受试者耐受性良好，最常见的不良反应是胃肠道症状、头痛和头晕，有两名受试者的ALT 和AST 出现1 级升高，8 名受试者的淀粉酶轻度升高［49］。随后一项涉及40名健康志愿者的随机对照试验中，受试者每天接受1～16 mg/kg 剂量的注射，其中10 名参与者出现头痛或其他轻微副作用，但未发现安全问题或严重不良反应事件。根据nHPs 和24 h 药时曲线下面积推算出，人体保护剂量为9.6 mg/kg，而蒙特卡洛模拟支持的保护剂量为11 mg/kg［47］。

2.4 小干扰RNA（siRNAs）利用siRNA 抑制病毒基因表达是抗病毒研究的新兴领域，并且是目前为数不多的具有前景的抗MARV 治疗方法之一。siRNA 通过空间阻断或触发DNA/RNA 双链的断裂来干扰mRNA 翻译。研究人员确定了一种靶向MARV NP 的siRNA（NP-718m），被脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，LNP）包裹时，可在体外抑制MARV 的复制，同时可通过与内体膜融合而进入细胞，并在豚鼠体内对3 种马尔堡病毒株（MARVAngola/Musoke、RAVV）表现出广泛的保护作用［50］。在另一实验中，对感染MARV的恒河猴进行NP-718-LNP 的进一步研究，使用致命剂量的MARV-Angola株攻击后30～45 min、24 h、48 h 和72 h 静脉注射NP718-LNP，所有接受治疗的动物全部存活，而未经处理的对照组在感染后7至9 d内死亡，这表明该药可在nHPs 中有效治疗MARV-Angola 的感染［51］。目前至少有14种siRNAs进入临床试验。

3 总结

世界各地的科研人员已经对MARV 研究数十年，从病毒的流行病学、发病机制、传播途径以及预防治疗等方面进行深入的探索，由于MARV 是高度致命的烈性传染病病原体，可引起严重出血热并迅速进展为感染性休克，被列为A级致命病原体，需要在生物安全4 级的实验室开展研究，因此研究过程存在诸多困难和风险。目前尚无针对MARV 的预防性疫苗及抗病毒药物上市。综合考虑，预防性疫苗中腺病毒或rVSV载体疫苗是目前最有前景的；而mAb 作为治疗MARV 的潜在首选治疗方案正在进行临床验证，BCX4430 可能是除mAb 制剂（如MR-191-N）以外的第二选择。需要注意的是，即使采取了上述治疗方案，支持性护理——包括密切监测生命体征、液体复苏、电解质和酸碱监测——也是必不可少的关键一环，同时必须积极应对可能的疫情，预防二次传播和散发性感染，一旦发现应立即报告，严密隔离。期待抗MARV 药物早日上市，造福人类。