PCR检测技术在动物毛绒分析鉴别中的应用进展

韩 军，耿 榕，孙 旸，王 超，孙 敬

（北京市产品质量监督检验研究院/国家纺织及皮革产品质量检验检测中心，北京 100025）

动物毛绒纤维是畜牧业的重要产品，被公认为高档的纺织工业原材料，具有保暖性好、弹性好、吸湿性好、手感柔和等优点[1]。毛绒制品的品质极高且具有良好的服用性能和保暖性能，深受广大人民的喜爱[2]。但是个别生产企业为了追逐利益、降低成本，将低值、低质的纤维混入动物毛绒中，进而出现含量虚假的动物毛绒制品，破坏了消费市场，损害了人民群众的利益，因此，准确鉴别毛绒极其重要[3]。传统的毛绒鉴别方法有显微镜法、溶液法和光谱分析法等，但误判率较高[4]。纺织面料的毛绒有羊毛、羊绒、兔毛、狐狸毛等，由于分属不同动物，物种间存在基因差别，检测脱氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic Acid，DNA）可以作为鉴定毛绒的有效途径。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）检测技术具有特异性好、多态性强、易于观察等特点，近年来，已广泛用于毛绒的鉴别研究。本研究介绍了DNA检测技术和毛绒基因组DNA提取方式，并对PCR检测技术在毛绒分析鉴别中的应用进行了简要综述。

1 DNA检测技术

DNA是生物体正常运转和发育必不可少的生物大分子，其含有大量生物体所必需的遗传信息。世界上有羊、熊猫等各类动物，还有微小的病毒、细菌、真菌，这个丰富的世界无一不与DNA有关[5-6]。DNA分子结构呈双螺旋状，两条多脱氧核苷酸链围绕一个中心轴盘绕。脱氧核糖-磷酸链在螺旋结构的外面，碱基朝向里面。两条多脱氧核苷酸链反向互补，通过碱基间的氢键形成的碱基对相连，形成稳定的结构。DNA中的核苷酸的碱基排列顺序构成遗传信息。

DNA不仅存在于生物的细胞核内，还存在于叶绿体和线粒体内，含量较少，需要将其扩增后才能进行相关检测。PCR最大的特点是能使微量的DNA大幅增加，即在生物体外复制特定的DNA，是一种用于扩增放大特定DNA片段的分子生物学技术[7]。因此，无论是古生物化石还是现在动物或人类的血液、毛发，只要能分离出微量的DNA，就能用PCR进行放大。PCR是利用DNA在体外95 ℃高温变性，变成单链，在60 ℃左右时引物与单链基于碱基互补配对的原则结合，再将温度调至72 ℃左右，使DNA聚合酶沿着5'→3'的方向合成互补链。

DNA检测技术包括PCR法、分子杂交技术、基于DNA结合蛋白方法、环介导等温扩增技术（LAMP）等，其中，广泛用于毛绒分析鉴别的是PCR法。实时定量PCR法是被众多分子生物学实验室广泛采用的一种方法，其基于PCR扩增，引物和特异性荧光探针同时加入，在增加扩增产物的同时，荧光信号一同增强，通过对PCR体系产生的荧光信号进行实时监控并进行定量分析[8]。定量PCR可实时检测产物含量，且PCR后的处理工序简便，实验操作周期短、操作难度较低，检测结果准确、特异性强。

DNA片段用特异设计的PCR引物扩增目标材料时，若检测其多态性，则需要对相应PCR扩增片段进行酶切处理。限制性片段长度多态性聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP）技术是采用PCR技术扩增目标DNA片段，然后用限制性内切酶将目标检测DNA进行酶切，限制性内切酶识别特异性DNA序列后进行切割，使用电泳对酶切产物进行分析后，由限制酶图谱分析次段序列的特异性切位点，通过比对酶切片段的多样性，实现对不同来源基因序列的差异性分析[9]。简而言之，就是先将目标DNA片段进行PCR扩增，然后进行限制性内切酶酶切反应，进行电泳分析后再观察，通过比较限制性图谱来分析序列之间的差异。

2 毛绒基因组DNA的提取方法

毛绒基因组DNA抽提的关键在于破坏毛绒外层的角质层，进而释放出毛干中极少量的DNA。常用的毛干DNA提取方法有以下4种：Chelex-100法、PCR法、二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）-裂解液法和试剂盒法等。

2.1 Chelex-100法

Chelex-100是一种化学螯合树脂，主要成分为苯乙烯和二乙烯苯共聚体，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可与多价离子进行螯合反应，对高价金属离子的亲和力和螯合作用更强。在碱性、低离子强度和煮沸的条件下，该物质可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心操作，可以去除Chelex颗粒，将DNA与Chelex-100结合的物质分离。Chelex-100能有效去除非核酸有机物，可用于提取血痕、全血、精斑、精液、毛发等样品中的DNA。吕雪峰等[2]和邵碧英等[3]各自的研究团队利用Chelex-100法成功提取了羊绒和羊毛中的DNA。刘艳艳等[10]将Chelex-100法与其他提取方法进行比较，并成功提取了狐狸、骆驼、山羊、绵羊等8种动物毛绒的基因组DNA。

2.2 PCR法

PCR法是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，可以将生物体外的特殊DNA片段进行复制，使微量的DNA大幅增加。使用PCR缓冲液、MgCl2溶液和蛋白酶K为裂解提取液，不仅可以从羊绒毛干中快速提取DNA，还能有效进行PCR扩增[11]。

2.3 DTT-裂解液法

DTT是一种小分子有机还原剂，其用途之一是作为巯基化DNA的还原剂和去保护剂。在DNA溶液中加入DTT，反应一段时间后除去，可以抑制DNA的二聚化。在高浓度DTT条件下，动物纤维经活性蛋白酶K预处理后，被裂解缓冲液裂解而释放出线粒体DNA，然后用顺磁性树脂将DNA吸附，接着用洗涤缓冲液将树脂上残留的杂质洗掉，最后用洗脱缓冲液将树脂上结合的线粒体DNA洗脱下来，完成羊毛羊绒中DNA的提取[12]。

2.4 试剂盒法

DNA是遗传信息的载体，是重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达等实验，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是重要前提，因此，基因组DNA的提取是分子生物学技术中最重要、最基本的操作之一。目前，很多公司能提供用于毛绒基因组DNA提取的试剂盒。邵碧英等[3]使用组织和毛发DNA提取试剂盒，同时配有蛋白酶K和DTT，成功提取了羊绒和羊毛织品中的DNA。费静等[13-14]使用Promega DNA IQTM毛发DNA抽提试剂盒成功提取了兔毛、狐狸毛和羊绒中的DNA。王玫[15]使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0试剂盒对兔毛中的DNA进行了提取。向海等[16]使用进口商业试剂盒（QIAamp®DNA Investigator）对牦牛、山羊、绵羊等动物毛干纤维中的DNA进行了提取。

3 毛绒的分析鉴别

毛绒的生长受到了遗传信息的控制，而DNA是遗传信息的载体，应用DNA检测技术对毛绒进行分析鉴别正是基于此原理。据研究报道，毛绒的DNA遗传物质主要存在于线粒体内，所以在鉴别过程中要合理选取遗传物质。为避免外源生物的干扰，研究人员要非常注重基因组DNA的获取过程，并不断提高方法的特异性。PCR检测技术的精确度很高，但成本高、速度慢，对人员和设备技术要求高。因此，该类方法目前只运用于实验室中，尚未在行业内普及[17-19]。

李好磊等[9]采用PCR-RFLP技术，利用提取的羊绒和羊毛线粒体基因组DNA，根据Cytochrome b基因已知的DNA序列设计引物，使用内切酶Ssp Ⅰ进行酶切并得到不同长度片段，借助酶切图谱鉴别羊毛和羊绒样品。刘艳艳等[10]针对狐 狸、兔、绵羊、骆驼、山羊等8种动物毛绒，建立了多重实时荧光PCR检测体系，方法具有特异性强、重复性好和灵敏度高等优势。费静等[13-14]和Tang等[20]使用实时荧光定量PCR技术，建立羊毛、兔毛、狐狸毛、羊绒、牦牛绒等动物纤维的定量分析方法。王玫等[15]借助荧光定量PCR技术，建立了兔毛定性检测方法。向海等[16]使用PCR法建立了牦牛、山羊、绵羊等动物毛干纤维中的DNA引物扩增、测序和特异引物扩增检测的系列方法，可用于毛绒的分析鉴别，具有灵敏度高、特异性强的优势。陈国培等[21]开发了适用于羊绒羊毛制品的DNA提取方法，建立了荧光PCR检测方法，该方法特异性较好、检出限较低、灵敏度优于传统方法。除上述实验室研究外，国家市场监督管理总局和中国国家标准化管理委员会陆续发布了毛绒DNA检测方法的国家标准，分别是GB/T 36433—2018《纺织品 山羊绒和绵羊毛的混合物DNA定量分析 荧光PCR法》和GB/T 40903—2021《纺织品 DNA分析法鉴别某些特种动物纤维 山羊绒、绵羊毛、牦牛绒及其混合物》，也极大地推动了PCR检测技术在纺织品检验检测行业的应用。

4 结语

PCR检测技术具有设备先进、特异性强、灵敏度高等特点，但也具有成本较高、操作复杂、检验周期长、对人员技术水平要求高等劣势。因此，相关检测技术尚不能被广泛运用于纺织品检测实验室。但是，开发和使用DNA检测方法能实现对传统毛绒检验方法的有效补充，可以作为重要的辅助和确证手段，有助于提高检测机构的鉴别能力、检验水平和准确率。随着科技水平的不断提升和DNA检测方法研究的不断深入，毛绒检验检测行业也许很快迎来新时代。