乳腺癌肺转移前微环境形成机制及中医药干预研究进展

韩鸿宽，陶睿智，王爱云，2，吴媛媛，李晓曼，韦忠红，陆 茵，2

(1．南京中医药大学药学院，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，2．南京中医药大学江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心，江苏 南京 210023)

2020年，据世界卫生组织国际癌症研究机构统计结果显示，乳腺癌超越肺癌成为全球发病率最高的癌症[1]。乳腺癌是一种异质性疾病，根据分子以及组织病理特征可分为3种亚型：雌激素受体(ER)或孕激素受体(PR)阳性，人类表皮生长因子受体(HER)阳性、三阴型乳腺癌(ER-、PR-、HER-)。乳腺癌的发生发展到遗传，环境等多种因素的影响。对于原发部位的乳腺癌，已有靶向药物以及手术切除方法进行治疗，而大多数乳腺癌患者往往因转移而死亡。乳腺癌常见的转移部位有肺脏、骨髓、肝脏等。乳腺癌对于特定器官转移的倾向性受到乳腺癌分子分型的影响，其中以三阴性乳腺癌的肺转移率最高。临床上，其中大约60%～70%的乳腺癌患者因肺转移而死亡。因此，探究乳腺癌转移机制对于临床上乳腺癌转移患者的治疗至关重要。

近年来，大多数研究都聚集在了PMN形成的机制研究上。PMN是由原发部位的肿瘤通过分泌肿瘤衍生因子，细胞外囊泡等到达肿瘤未来的转移部位，并引发一系列有利于肿瘤生存定植的生物学事件，例如引起转移部位炎症、血管渗漏、募集骨髓来源细胞等从而改变转移器官的微环境以适应循环肿瘤细胞的定植[2-3]。因此，PMN的形成在原发肿瘤进行远端转移的过程中具有重要作用。然而，PMN的形成机制较为复杂，受到多种细胞以及相关细胞因子的调控。因此，阐明PMN的形成机制对后续的抑制肿瘤PMN形成的治疗是至关重要的。近年来，乳腺癌PMN的形成机制被不断揭示，干预乳腺癌PMN也逐渐成为治疗乳腺癌转移的一种重要手段。中医药治疗疾病具有多靶点、多环节的作用特点，目前使用中医药对多种疾病已有确切疗效。在肿瘤发生发展的各个环节中，中医药的干预能起到主要或辅助治疗作用。因此，中医药干预PMN的形成有望成为一种有效的治疗手段。本文综述了乳腺癌肺PMN的发生的机制以及中医药干预治疗的研究进展，为后续的治疗研究提供了思路。

1 转移前微环境(PMN)

1889年，Piget的种子土壤假说表明肿瘤转移依赖于种子(肿瘤)以及土壤(转移器官微环境)相互作用，在之后的一个世纪里，相继有学者发表不同观点，James Ewing在1928年提出肿瘤转移仅仅依赖于血液动力学，而在1976年Isaiah Fidler利用静脉注射以及心内注射模型表明循环肿瘤细胞的转移定植不仅取决于血液动力学的因素，肿瘤本身具有一定的转移倾向性[4]。那么，在转移过程中肿瘤与靶器官之间是否具有相互作用，其作用机制又是什么？直到2005年，Kaplan等[3]第一次提出了PMN这一概念，他们观察到在LLC的皮内原位模型中，VEGFR1+的骨髓来源造血祖细胞比肿瘤率先到肺脏，并使肺中血管异常化从而为转移提供有利的定植条件。同时，他们使用黑色素瘤的条件培养基与LLC细胞共孵育后再注射至小鼠体内时，LLC转移到了黑色素瘤常见的转移部位中，这凸显出了肿瘤来源的分泌因子在肿瘤转移器官倾向性中的重要作用。与此相符的是，近几年来的大量研究都表明肿瘤来源的外泌体以及细胞外囊泡在PMN形成中的重要作用。

然而，肿瘤衍生因子(TDSF)在形成PMN过程中需要与靶器官中的多种细胞进行复杂的相互作用，以此使原本正常器官发生病变从而建立起PMN。PMN也具有6大特征，包括炎症、免疫抑制、血管渗漏等。TDSF可以通过募集骨髓来源细胞，促使转移靶器官中血管通透性增加以及介导炎症信号来为之后的CTC定植提供有利环境。然而，不同类型的癌症以及转移靶器官导致PMN中的成分也各不相同，同时这也决定了PMN的形成机制也有所差异。因此，PMN的形成机制仍在不断被研究之中。

2 乳腺癌肺PMN形成机制

乳腺癌的不同亚型具有不同的侵袭性，其中以三阴性乳腺癌(又称基底样乳腺癌)的侵袭性最强。同样，乳腺癌的不同亚型也是乳腺癌具有不同器官转移倾向性的主要原因之一，而三阴性乳腺癌细胞往往具有高肺转移的特点。临床上，大约有60%～70%的乳腺癌患者因诊断为肺转移而发生死亡[5]。有研究表明[6]，肺转移在ER+/PR+的乳腺癌患者占约21%，在HER2+乳腺癌患者占约25%，肺转移在三阴性乳腺癌中更是占到了40%。但目前，不同乳腺癌分子分型在肺转移的时间点以及转移的分子机制目前仍未研究清楚。因此，需要充分了解乳腺癌肺转移的机制以应对乳腺癌肺转移。

2.1 血管渗漏肺作为一种血管网络较为丰富的器官，是血液流通的重要枢纽，然而这也同样为乳腺癌的转移提供了便利。血管渗漏是PMN形成最早发生的生物学事件。血管通透性的增加是血管渗漏的重要标志之一。肺血管通透性的增加不仅有助于PMN的形成，也为肿瘤转移外渗出血管促进肺定植提供了有利条件。研究表明[7]，乳腺癌分泌的miR-105靶向破坏肺微血管内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1从而增加血管通透性促进乳腺癌肺转移。Jiang等[8]利用4T1原位小鼠模型发现血清中升高的血管内皮生长因子VEGF诱导转移前肺微血管紧密连接蛋白ZO-1破坏，该机制可能与VEGF-PKC途径相关，使用贝伐单抗阻断VEGF可逆转其诱导的血管通透性增加。另一项研究发现，occludin 磷酸化/泛素化途径也可能是肺PMN中VEGF诱导肺血管通透性过高的机制[9]。Liu等[10]发现原位乳腺癌诱导肺中总血管密度增加，体外使用VEGF可诱导小鼠肺微血管内皮细胞(MPVEC)中前列腺素E2(PGE2)的产生并增强4T1细胞的黏附。环氧合酶2(COX-2)抑制剂塞来昔布的治疗显着降低了4T1细胞对MPVEC的黏附，同时减少了癌症转移。

虽然使用VEGF等靶向药物能够逆转PMN形成过程中所带来的血管异常，但靶向药物带来的副作用同样也是十分严重，并且临床上目前单抗药物并非有应用于治疗转移前微环境的方案。因此，单抗药物靶向治疗肿瘤转移前微环境的有效性以及安全性仍然需要进一步的研究阐明。由于，中医药的治疗具有毒副作用小的特点，针对靶点进行中药的开发也不失为一项有前途的治疗策略。

2.2 骨髓来源细胞(BMDC)骨髓来源细胞(BMDC)也是该形成过程中的重要角色，BMDC包括中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞等。虽然以中性粒细胞、巨噬细胞为代表的骨髓来源免疫细胞是体内重要的炎症细胞。但随着单细胞组学技术的发展，BMDC的高度异质性已被阐明，不同表型的BMDC在肿瘤的发生发展中扮演了不同的角色，在PMN形成的过程中，BMDC被表明介导了PMN中的免疫抑制反应，通过释放相关细胞因子如IL-10、Arg-1等抑制T、NK细胞的活化，从而抑制其抗肿瘤活性以促进转移的肿瘤细胞逃避免疫杀伤。在临床上，患者肿瘤微环境中的中性粒细胞以及巨噬细胞的浸润与患者的不良预后相关。因此，BMDC目前已经成为了癌症治疗的一个重要靶点。

2.2.1VEGFR1+造血祖细胞(HPC) VEGFR1+造血祖细胞(HPC)是最早被发现在黑色素瘤以及肺癌模型中在PMN中募集的一类骨髓来源细胞。Meng等[11]在构建表达荧光素酶报告基因的MDA-MB-435s乳腺癌细胞小鼠肺转移模型中也发现VEGFR1+CD133+的骨髓来源造血干细胞在肺中的募集增加，体内使用MMP-9、PDGFR-α和PECAM-1的特异性抑制可减少VEGFR1+CD133+HPC的向肺中的募集并减少乳腺癌肺转移。

然而，此类骨髓来源细胞在乳腺癌肺PMN中的研究较少，大部分的研究仍然集中于肿瘤相关中性粒细胞以及巨噬细胞对于乳腺癌肺PMN的影响。但已有使用VEGFR1的靶向药物治疗转移性结肠癌，因此，该类细胞也可能成为治疗乳腺癌肺转移的潜在靶点。

2.2.2肿瘤相关中性粒细胞(TAN) 中性粒细胞发源于骨髓造血祖干细胞，在骨髓中发育成熟后，其表面受体由CXCR4转变为CXCR2(IL-8)受体，通过血液中CXCL8的趋化作用下释放进入血液循环中。中性粒细胞是人体抵抗病原微生物感染的第一道防线，然而在肿瘤的发生发展中，肿瘤相关中性粒细胞(TAN)充当了双面角色[12]。最早提出将TAN可以类似于巨噬细胞分为N1与N2表型的是Friedlander等[13]，N1型TAN通过直接或间接的细胞毒性发挥抗肿瘤活性[12]。N2型TAN通过DNA不稳定或细胞因子和趋化因子的释放刺激免疫抑制、肿瘤生长、血管生成和转移[14]。TAN在促进肿瘤PMN形成中的作用目前已被证实。在Ⅰ型干扰素信号受损的小鼠[Ifnar1(-/-)]的LLC以及4T1小鼠皮下模型中，肺部出现了大量TAN的积累，并伴随着肺部Bv8、MMP9、S100A8 和 S100A9蛋白水平表达升高以促进PMN的形成。Wang等[15]通过在4T1原位乳腺癌小鼠模型以及MMTV-PyMT自发性乳腺癌肺转移小鼠模型中发现了一类中性粒细胞群体CD62Ldim中性粒细胞，该类中性粒细胞能够通过CXCL12/CXCR4轴特异性趋化至肺中形成乳腺癌肺PMN。在一项关于尼古丁暴露对乳腺癌PMN的影响实验中，尼古丁的长期暴露通过诱导并募集促肿瘤N2表型的中性粒细胞促进肺PMN的形成，进而激活LCN2(一种来自N2型TAN的分泌糖蛋白)释放，诱导转移乳腺癌细胞MET过程，促进乳腺癌细胞在肺中的定植，使用红景天苷能够减少尼古丁暴露诱导的TAN的N2极化抑制其在PMN中的募集从而减少激素受体阴性的乳腺癌细胞肺转移[16]。

TAN的募集同样也受到原发乳腺癌细胞分泌的因子趋化作用的影响。在缺氧的原位乳腺癌肿瘤微环境下，其分泌的TDSF有助于骨髓来源的CD11b+/Ly6Cmed/Ly6G+粒细胞以及低细胞毒性的NK细胞在肺中的募集促进免疫抑制PMN的形成[17]。此外，有研究表明，原位乳腺癌分泌的氧甾醇通过募集N2型TAN从而促进肺PMN形成[18]。原位乳腺癌缺氧条件下诱导的酶碳酸酐酶IX(CAIX)通过刺激粒细胞样的MDSC通过G-CSF募集至肺中形成PMN来促进转移[19]。

因此，中性粒的表型对于乳腺癌肺PMN的形成至关重要，虽然已有多种靶向药物抑制N2型TAN的趋化从而抑制乳腺癌肺转移，但靶向药物同样也将N1型TAN的趋化抑制从而影响机体免疫。未来的研究应着重于如何精准靶向N2型TAN同时保留N1型TAN从而协同促进抗肿瘤转移。此外，阻断原位乳腺癌分泌的TDSF进而抑制TAN的募集趋化同样也是一个潜在的治疗靶点。

2.2.3肿瘤相关巨噬细胞(TAM) TAM目前已被报道通过多种机制促进乳腺癌转移[20-21]，巨噬细胞在PMN中介导的免疫抑制反应是由于巨噬细胞的表型改变，在乳腺癌肺PMN形成过程中，CYP4A+TAM通过极化成M2表型并释放TGF-β，VEGF和SDF-1增强VEGFR1+骨髓来源细胞在肺中的募集和成纤维细胞的活化[23]。因此，通过改变巨噬细胞的表型也可能是抑制PMN形成并抑制肿瘤远端转移的治疗策略。

2.3 其他因素此外，乳腺癌肺PMN的形成与心理压力也有关联，在慢性不可预见性应激(CUS)造模的尾静脉乳腺癌转移模型小鼠中，使用β-肾上腺素能激动剂异丙肾上腺素(ISO)处理小鼠能够促进转移前阶段肺中巨噬细胞浸润。该作用机制可能与ISO刺激上调了肺基质细胞中CCL2和单核细胞/巨噬细胞中 CCR2 的表达，导致巨噬细胞募集和浸润到转移前的肺中。对β-肾上腺素能信号通路的药理抑制能够显着抑制压力诱导的肺转移[24]。在使用高脂饮食的乳腺癌原位小鼠模型中，使用甘草酸(GA)能够改善肠道微生物组成以及抑制M1样结肠巨噬细胞介导的LPS/HMGB2/NF-κB信号来抑制CCL2和TNF-α的产生，从而抑制Gr-1+骨髓细胞的迁移和S100A8/9的表达抑制肺PMN的形成[25]。

由此可见，在乳腺癌肺PMN的形成机制过程中，除了已被大部分研究表明的血管渗漏以及免疫抑制等机制之外，仍然存在着心理压力，肠道菌群等因素的调控影响。这为后续的PMN的形成机制研究拓宽了思路，同样也揭示了丰富的潜在治疗靶点。

3 中医药干预肺PMN形成治疗研究

中医治疗肿瘤PMN的理论始于2007年，大多学者认为中医药治疗PMN符合“治未病”的中医学术理论，中医认为肿瘤PMN的形成是由于转移靶器官“正虚”，以及受到“癌毒”侵扰以及具有“气滞痰凝血瘀”的病理状态。并提出以“扶正培本、清热解毒、理气祛痰，活血化瘀法”改善PMN，从而抑制患者肿瘤转移，改善肿瘤患者的预后。

目前，已有报道中医药在干预肿瘤PMN中的治疗作用。Tian等[26]通过对4T1原位荷瘤小鼠模型灌胃不同剂量的保元解毒汤发现，具有补气血，增强免疫功能的保元解毒汤可以通过TGF-β/CCL9通路抑制具有免疫抑制功能的髓源抑制细胞(MDSC)在肺PMN中的积累从而延长了4T1荷瘤原位小鼠的生存时间并减少了肿瘤转移。使用中药消痞方能够抑制乳腺癌PMN的形成从而抑制肺转移，其机制是通过抑制M2型巨噬细胞上的CXCL1表达从而减少骨髓中的HSPC的募集以及其向MDSC的分化[27]。另一项研究表明使用中药复方乳移平与桔梗联用可以通过保护肺血管完整性来抑制纤维蛋白原的外渗，并中断其与原位癌的相互作用，从而抑制炎症性PMN的形成[28]。

乳腺癌肺PMN的形成机制复杂多变，受到肿瘤细胞、免疫细胞等多种细胞的互作调控，临床上抑制乳腺癌肺PMN的形成目前也无任何靶向药物的治疗。中医药干预乳腺癌肺PMN的形成不仅符合中医传统理论，其相应的实验研究也表明其具有一定的科学内涵。因此，利用中医药复方多成分，多环节，多靶点的整合调节作用的治疗特点抑制乳腺癌肺PMN形成是一个具有前途的治疗策略之一。

4 展望

临床上，接受治疗的乳腺癌肺转移患者的预后仍然很差。大部分患者在确诊肿瘤之后已经发生了远端转移。因此，对其的治疗策略应该尽早进行诊断治疗。肿瘤PMN的形成是肿瘤远端转移的重要先决条件之一，干预肿瘤PMN的形成也成为近几年来治疗肿瘤转移的重要治疗策略。临床上，目前对于PMN的检测缺乏有效的手段[22]，但已有报道在乳腺癌动物模型中使用基于抗体的单光子发射计算机断层扫描(SPECT)在体内检测以S100A8/A9 作为转移前靶器官标记物的成像系统的应用以检测PMN中的免疫微环境状态[29]。这可能为后续应用基础及临床研究提供了方法。另外，通过3D生物打印技术构建体外肿瘤微环境，使得研究精准研究肿瘤转移分子机制成为了可能，这也为临床前药物筛选提供了平台。同时，这可能也为PMN的体外研究并为PMN的精准治疗提供思路。

由于PMN的形成机制复杂，治疗的难度也大大提高。最近，在自发性肺转移的横纹肌肉瘤小鼠模型中，有研究表明，可通过基因工程改造的骨髓来源细胞(GEMys)利用其归巢特性将细胞因子IL-12递送至肺部改善PMN从而减少肿瘤转移，这为后续其他癌症模型的PMN治疗以及临床应用奠定了基础[30]。以多成分、多靶点治疗为特点的中医药可能是干预PMN形成的治疗策略，目前对于中医药干预PMN的形成机制主要在于重塑免疫微环境，以及保护血管通透性方面。然而，PMN也具有代谢异常等特点，同时，改善免疫抑制微环境不仅取决于减少以骨髓来源细胞介导的免疫抑制反应，同时也要激活T，NK细胞活化的相关的代谢途径以促进其介导肿瘤杀伤效应。那么，一方面从改善PMN代谢的角度出发是否也能够起到干预治疗肿瘤PMN的效果？另一方面配伍改善代谢与免疫微环境重塑的中药是否可能有协同起效的作用？因此，仍然需要继续对中医药的疗效进行深度挖掘并加以创新。此外，未来或许可能利用构建的体外PMN进行有效的中药配伍成分的筛选。