辣椒素改善实验小鼠急性肺损伤氧化应激的研究

李利玲 刘 欢 廖慧敏 胡金鑫 刘凤晓 赵 棋 高 强

(1 湖南中医药大学，长沙，410208；2 中南大学，长沙，410083)

内毒素所致肺损伤发生比较迅速，挽救的时间窗口比较短暂，同时肺损伤也是内毒素小鼠死亡的主要原因之一。各种因素导致的急性肺损伤(Acute Lung Injury，ALI)共同病理改变为广泛严重的肺泡损伤和间质性肺水肿，肺泡腔内大量炎症细胞浸润，灌洗液中的炎症介质明显增多，肺泡上皮细胞凋亡或死亡[1-2]。内皮细胞学说则认为内皮或上皮细胞的凋亡，直接造成了肺泡上皮或内皮屏障功能障碍，血管通透性增加，肺水肿加剧[3]。本实验通过采用腹腔注射内毒素方法制造白化的家鼠亚系(Bagg Albino，Laboratory-bred Strain of the House Mouse，BALB/c)小鼠ALI模型，用辣椒素干预后硫代巴比妥酸(Thiobarbituric Acid，TBA)化学比色法检测小鼠丙二醛(Malondiachehyche，MDA)水平；一氧化氮还原酶法测定氮氧化物(Nitrogen Oxide,NOX)水平；酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)检测各组小鼠肺组织肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)水平，以及在光镜下观察各组小鼠肺组织病理学改变，以期为辣椒素干预内毒素所致ALI小鼠氧化应激反应改善提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 120只无特定病原体(Specefic Pathogen Free，SPF)级BALB/c小鼠，4～6周龄，雄性，体质量18～22 g，购自武汉蜂鸣生物科技有限公司，动物购买许可证号SCXK(湘)2018-0003，动物使用许可证号SYXK(湘)2018-0004。伦理审批号：HN.No20180930b1000120，于湖南中医药大学SPF级动物房中饲养，给食颗粒饲料，自由饮水，动物房温度(25±1)℃，相对湿度40%～70%，自然昼夜光照。

1.1.2 药物 辣椒素(上海源叶生物科技有限公司，货号：B2069)和脂多糖(福州奥研实验器材有限责任公司，货号：HX100003929)。

1.1.2 试剂与仪器 一氧化氮(Nitric Oxide，NO)测定试剂盒(硝酸还原酶法，南京建成生物工程研究所，货号A012)和MDA测定试剂盒(TBA法，南京建成生物工程研究所，货号:YBA003-1)，TNF-α ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司，货号:EMC102a)、IL-1β ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司，货号:EMC001b)，4%多聚甲醛组织固定液(长沙国昌生物技术有限公司，货号:AR1069)。倒置显微镜(OLYMPUS公司，日本，型号:CX23)，全自动石蜡切片机(SLEE公司，德国，CUT6062型号)等，全波长酶标仪(Thermo公司，美国，型号:Multiskan Sky)，摊片机(SKU公司，美国，型号:KD-PⅢ)，电热恒温培养箱(峥嵘仪器公司，型号:DHP260)等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将小鼠120只采用随机数字法分为4组：正常对照组，辣椒素对照组，内毒素急性肺损伤组，辣椒素+内毒素干预组，每组30只。

1.2.2 给药方法 正常对照组：小鼠腹腔注射生理盐水，分别于干预后22 h、4 h、6 h时麻醉处死；辣椒素对照组：先给小鼠皮下注射辣椒素1.0 mg/kg，30 min后腹腔注射生理盐水，分别于干预后2 h、4 h、6 h时麻醉处死；急性肺损伤组：给小鼠腹腔注射内毒素10.0 mg/kg，构建ALI模型，分别于干预后2 h、4 h、6 h分批麻醉处死；辣椒素干预组：先小鼠皮下注射辣椒素1.0 mg/kg，30 min后腹腔注射内毒素10.0 mg/kg，分别于干预后2 h、4 h、6 h分批麻醉处死。以上各组处死后取肺组织，固定于4%多聚甲醛中，4 ℃保存备用。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 比色法检测MDA含量 按照实验分组，取10%肺组织匀浆，用二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法测定其蛋白含量，采用比色法，检测肺组织MDA水平，严格按照试剂盒说明书操作。机体产生的氧自由基能通过脂质过氧化物的分解产物MDA引起细胞损伤。因而测试MDA的量常常可间接地反映出细胞损伤的程度。过氧化脂质降解产物中的MDA可与TBA缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰。实验取样品100 μL，按比例加入试剂一、试剂二、试剂三，旋涡混匀器混匀，95 ℃水浴40 min，3 500～4 000 r/min，离心半径10 cm，离心10 min，取上清100 μL，532 nm处，测各管光密度(Optical Density，OD)值。见表1。

1.2.3.2 NO还原酶法检测NOX水平 按照实验分组，摘眼球取血，离心取血清，用NO还原酶法测定NOX水平，按照试剂盒说明书操作。取血清原液100 μL，按步骤加入样本一100 μL，样本二200 μL，混合试剂，37 ℃水浴60 min，再加入R3、R4，抽提室温静置40 min，3 500～4 000 r/min，离心半径10 cm，离心10 min，取上清160 μL，加入显色剂，静置10 min，550 nm测各管OD值。见表2。

1.2.3.3 ELISA法检测TNF-α、IL-1β水平 按照实验分组，取10%肺组织匀浆，用BCA法测定其蛋白含量，采用QuantiCyto® ELISA试剂盒双抗夹心法检测肺组织TNF-α和IL-1β水平，按照试剂盒说明书操作。抗小鼠TNF-α和IL-1β单抗包被于酶标板上，标本中的TNF-α和IL-1β与单抗结合，洗涤，加入生物素化的抗小鼠TNF-α和IL-1β抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素，洗涤，加入显色底物，洗涤，加终止液，若阳性则显黄色，阴性无色，在450 nm处测OD(光密度)值。见表3～4。

1.2.4 病理学观察 按照实验分组，将肺组织于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，进行切片和HE染色，在放大400倍光镜下观察肺组织病理学改变。

2 结果

2.1 辣椒素干预前后小鼠肺组织MDA、NOX、TNF-α、IL-1β比较 与正常对照组比较，内毒素组小鼠肺组织MDA水平明显升高(P<0.05)，辣椒素对照组则变化不明显(P>0.05)，与内毒素组比较，辣椒素+内毒素干预组小鼠肺组织MDA水平在2 h、4 h、6 h明显降低(P<0.05)。与正常对照组比较，内毒素组小鼠肺组织NOX水平明显升高(P<0.05)，辣椒素对照组则无明显变化(P>0.05)，与内毒素组比较，辣椒素+内毒素干预组肺组织NOX水平在4 h、6 h明显降低(P<0.05)。与正常对照组比较，内毒素组小鼠肺组织TNF-α、IL-1β水平明显升高(P<0.05)，辣椒素对照组则变化不明显(P>0.05)，与内毒素组比较，辣椒素+内毒素干预组小鼠肺组织在4 h、6 h TNF-α、IL-1β水平明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠肺组织MDA、NOX、TNF-α、IL-1β水平变化及辣椒素干预结果

2.2 各组小鼠肺组织病理学改变 光镜下，正常对照组、辣椒素组肺组织结构清晰，肺泡腔内无炎症细胞浸润，无出血或有少量出血，肺间质无明显渗出；急性肺损伤组2 h损伤不明显，但4 h、6 h可见肺泡腔大小不等，部分肺泡壁断裂呈气肿状，部分增宽，肺泡毛细血管扩张，部分肺泡内可见出血，肺间质水肿，可见炎症细胞浸润；与急性肺损伤组比较，辣椒素干预组肺泡壁增厚、毛细血管扩张、炎症细胞浸润及肺间质水肿程度均明显减轻。见图1。

图1 不同组别不同处理时间小鼠肺组织病理学变化(HE染色，×400)

3 讨论

ALI是呼吸系统疾病中最常见的导致死亡的原因之一，同时ALI也是肺炎和急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)等其他疾病发展的重要风险因素[4-5]。由于其病情发展迅速同时病死率较高，其发病机制仍处于探讨之中，同时缺乏明确的治疗手段，因此目前在呼吸疾病中越来越受到重视。

此前已有研究表明氧自由基损伤是ALI的一个重要因素，其细胞脂质过氧化的降解产物主要就是MDA，其大小可以间接反映细胞氧化损伤的程度[6]。降低ALI细胞和大鼠模型中MDA和NO的水平，抑制SOD活性，可明显减轻内毒素所致的肺组织病理改变[7]，本研究中小剂量辣椒素作用于ALI模型小鼠后可降低血清MDA水平，可以在一定程度上减轻ALI造成的氧化应激损伤。

Wu等[8]研究发现辣椒素对小鼠体内的2种NO合酶均有促进作用。而Demirbilek等[9]采用不同剂量辣椒素干预脓毒症大鼠，发现小剂量辣椒素可以抑制大鼠血清NOX水平，但具体机制不明。唐婧等[10-11]研究不同处理因素对脂多糖诱导巨噬细胞后相关炎症介质表达的影响，明确辣椒素的抗炎效应表明辣椒素具有抗炎的作用，并发现瞬时受体辣椒素电位1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1，TRPV1)是辣椒素在治疗ALI/急性呼吸窘迫综合征作用中的新靶点。南超等[12]初步研究过辣椒素对小鼠ALI氧化应激的影响，测定了辣椒素作用下肺组织SOD、MDA以及血红素氧合酶等的表达变化，发现辣椒素有改善小鼠ALI氧化应激的作用，但没有进一步测定NOX、TNF-α、IL-1β等与氧化应激相关关键因子的表达变化，因此本研究的完成对于进一步探索辣椒素改善小鼠ALI氧化应激的作用就显得特别有意义。

本实验发现小鼠体内NOX水平变化趋势为急性肺损伤组>辣椒素加急性肺损伤组>辣椒素组>正常对照组。血浆NOX水平的升高可能与多器官衰竭的发生有关，小剂量的辣椒素降低了ALI小鼠血浆中的NOX水平，其可能的机制是小剂量的辣椒素干预可能使小鼠产生较小数量的细胞因子，例如TNF-α、IL-1β等，从而减少NOX产生。

目前的主流观点认为，内毒素注射入人体后会导致全身炎症反应，表现为全身炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)，刺激机体释放炎症介质，从而引发瀑布样级联反应，使肺泡上皮细胞及血管内皮细胞受损，间隙增大，大分子物质透过血管进入肺间质及肺泡内，从而引起肺部一系列的病理生理改变[13-14]。内毒素引起ALI动物肺泡腔和间质中性粒细胞募集、肺泡壁变薄和蛋白水肿液聚集在肺泡腔[15-16]；上皮细胞在动物注入内毒素后迅速凋亡并先于其他组织损伤发生[17]。

在实验中，通过腹腔注射辣椒素观察其对内毒素所致ALI小鼠的改善作用，结果显示，辣椒素能够降低实验小鼠中血清的炎症介质TNF-α、IL-1β的水平，同时提高抗炎症介质水平，说明了辣椒素可以调节炎症介质及抗炎症介质的平衡，从而减轻炎症反应，发挥对肺组织的保护作用。

本研究的实验结果中，辣椒素能调控炎症介质TNF-α、IL-1β等的释放，减轻内毒素所致肺损伤的炎症程度，降低ALI小鼠肺组织MDA和NOX水平，从而阻断肺损伤继续进展为ALI/ARDS，因而小剂量辣椒素对ALI有一定的保护作用。目前已有研究人员从磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-Kinase，PI3K)、蛋白激酶B(Protein Kinase B，PKB)以及核因子κB等信号通路对黄酮类等对脂多糖诱导小鼠ALI的保护作用机制进行了研究[18-20]。下一步我们拟继续对辣椒素改善实验小鼠ALI氧化应激的机制进一步研究。