SFTSV Gn关键氨基酸突变对细胞自噬与病毒增殖的影响

陈梦婷，邱 玲，杜蒙育，徐小莹，韦雪敏，崇小文，温红玲

发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)是发热伴血小板减少综合征(sever fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)的病原体，SFTS病死率可达30%[1]，被列为世界卫生组织建议优先紧急研究的十大传染病之一[2]。SFTS一旦暴发会给人类生命健康带来极大危害，是中国和其他流行国家的一个重要公共卫生问题。2021年该病毒被国际病毒分类委员会重新命名为大别班达病毒(Dabie bandavirus)[3]。

SFTSV是单股负链分节段RNA病毒，基因组由大(L)、中(M)、小(S)3个片段组成[4]，其中M片段编码的囊膜糖蛋白前体经宿主细胞内蛋白酶修饰后形成N端糖蛋白(glycoprotein n, Gn)和C端糖蛋白(glycoprotein c, Gc)[5]。Gn在病毒的组装、病毒颗粒的形成和吸附新的宿主细胞过程中发挥关键作用[6]，可与细胞表面蛋白的非肌球蛋白重链ⅡA结合，从而提高病毒早期感染效率[7]。糖蛋白介导了病毒结合并进入宿主细胞的复制周期的第一步，是中和抗体的主要靶点[8-9]。

三维结构建模分析表明，SFTSV Gn头域折叠成一个三角形结构，由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个子域构成，子域Ⅰ和Ⅱ支撑着在顶部突出的子域Ⅲ[10]。所有可被识别的B细胞表位(B cell epitopes, BCEs)都位于SFTSV Gn的表面，确定的5个BCEs中有3个位于SFTSV Gn头域中的子结构域Ⅱ[11]。本课题组前期研究结果表明SFTSV分离株JS2011-013-1感染Vero细胞无明显细胞病变，经多次传代后出现明显的细胞病变，比对两毒株基因序列发现Gn只有第323位氨基酸发生突变(I323V)[12]，且该氨基酸位于子结构域Ⅱ，推测该位点可能是影响病毒毒力的重要氨基酸位点。

研究发现SFTSV可引起细胞自噬并利用自噬通路进行病毒的组装和释放[13]。微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein Ⅰ light chain 3, LC3)是目前公认的自噬标志物[14]，SQSTM1(Sequestosome 1, p62)是自噬降解的指标[15]。因此，本研究检测SFTSV Gn及其关键氨基酸突变(I323V)引起细胞自噬相关蛋白p62及LC3表达水平的变化情况，以确定其对细胞自噬的影响。

本研究通过实现Gn和Gn(I323V)的真核表达，进而检测其对细胞活性、病毒复制和细胞自噬的影响以及两者之间的差异，结合预测的蛋白三级结构，为进一步研究SFTSV Gn的结构与功能以及发现抗病毒药物靶点提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

1.1.1 细胞、毒株、载体和抗体 SFTSV毒株JS2011-013-1由江苏省疾病预防控制中心惠赠；Vero细胞为本实验室传代保存；BSR-T7/5细胞(金黄仓鼠肾细胞)由武汉病毒所彭珂教授课题组惠赠；真核表达载体pcDNA3.1(+)购自武汉淼灵公司；人源SFTSV Gn蛋白单克隆抗体由武汉大学于学杰教授课题组惠赠[11]；异硫氰酸荧光素标记的山羊抗人IgG抗体购自美国Proteintech公司；鼠抗p62抗体购自abcam公司；鼠抗LC3B抗体购自CST公司；鼠抗β-actin抗体、羊抗鼠抗体购自中杉金桥公司。

1.1.2 主要试剂 病毒RNA提取试剂盒(E.Z.N.Z.TMViral RNA Ki)购自美国OMEGA公司； Evo M-MLV Plus cDNA合成试剂盒、OK Clon DNA连接试剂盒购自艾科瑞公司；高保真酶(KOD-Plus-)购自TOYOBO公司；限制性内切酶Hind Ⅲ、XbaⅠ购自TaKaRa公司；DH5α感受态细胞购自上海昂羽公司；转染试剂Lipofectamine 3000购自Thermo公司；qRT-PCR一步法荧光定量专用预混液购自诺唯赞公司。

1.2 SFTSV Gn蛋白三级结构预测 以突变后的SFTSV Gn蛋白序列为模板，在SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在线网址上进行同源建模，并将输出的模型在PyMOL软件中进行分析。

1.3 引物设计 根据SFTSV毒株和质粒pcDNA3.1(+)序列，利用Primer Premier 5.0软件根据同源重组克隆及重叠延伸PCR原理设计引物，序列见表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.7 建议与意见 问卷学生认为，目前学校开展的课外活动，形式单一，激发不了大家的积极性。他们希望学校多组织开展有意义、有趣味、有吸引力、贴近生活、不刻板形式化、能培养创新能力的课外活动，如：三观教育、实践活动、户外运动等；学生希望扩大课外活动的参与面，而不总是固定的那几个学生参加活动；学生周末空闲时间较多，有希望学校周末开放体育馆、提供锻炼场地的诉求。学生还反映在校生学风不够好，“低头族”群体大，部分学生素质较低、生活习惯较差等。有的学生也提出对学校没有门禁、存在安全隐患的担心。

表1 扩增目的片段引物信息Tab.1 Primer information for amplification of the target fragment

1.4 SFTSV Gn基因的扩增和鉴定 提取SFTSV总RNA，反转录合成cDNA。以Gn F和Gn R为引物合成Gn；以Gn F和Gn(I323V) R为引物合成Gn1，以Gn(I323V) F和Gn R为引物合成Gn2，再以Gn1和Gn2为模板合成Gn(I323V)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后送上海生工生物工程有限公司进一步测序分析。

1.5 真核表达载体的构建与鉴定 将琼脂糖凝胶电泳后的PCR产物以及经Hind Ⅲ和XbaⅠ双酶切的pcDNA3.1(+)质粒通过胶回收进行纯化，无缝克隆法连接质粒和目的片段。连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布平板后挑取单个菌落培养后提取质粒，将双酶切鉴定正确且测序结果一致的重组质粒命名为pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)。

1.6 重组质粒转染BSR-T7/5细胞及相关检测

1.6.1 瞬时转染BSR-T7/5细胞 将BSR-T7/5细胞接种到24孔板中，待细胞长至70%～80%时，PBS清洗3次，每孔加入1 mL Opti-MEM。分别将50 μL Opti-MEM培养基与1.5 μL转染试剂和1 μg重组质粒充分混匀，同时稀释空载体pcDNA3.1(+)设置为对照组；将上述两管预混液轻轻混匀后在室温孵育10～15 min后加入孔板，培养5 h后将培养液换成含1%胎牛血清的DMEM培养基，置于细胞培养箱继续培养。

1.6.2 间接免疫荧光检测 质粒转染48 h后，用预冷的80%丙酮-20 ℃固定12 h以上，PBS洗涤3次后加入1∶750稀释的人源SFTSV Gn蛋白单克隆抗体，37 ℃孵育1 h。回收一抗后PBS洗3次，加入1∶100稀释的FITC标记的二抗，37 ℃避光孵育1 h，弃去二抗。加入适量DAPI染液室温孵育5 min，PBS洗3次。荧光显微镜下观察。

1.6.3 Western Blot检测 提取转染48 h后的BSR-T7/5总蛋白，加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液100 ℃沸水浴10 min使蛋白变性。电泳后将蛋白从凝胶转移到PVDF膜，0.5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗膜3次；加入一抗孵育过夜，TBST洗膜3次；加入相应HRP标记的二抗，摇床孵育1 h，TBST洗膜3次。化学发光法检测蛋白表达情况，之后在Image J(https://ij.imjoy.io/)在线网址对蛋白条带进行灰度分析。

1.6.4 CCK-8检测 将BSR-T7/5细胞接种到96孔板中，共分为空白组、转染空载体组、转染pcDNA3.1(+)-Gn组和转染pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)组，每组设置6个复孔。质粒转染48 h，弃去原培养液，避光加入含10% CCK-8试剂的维持液，37 ℃孵育1 h。用酶标仪在波长450 nm处测定各孔吸光度(A)。根据公式：细胞存活率(%)=[A(实验)-A(空白)]/[A(对照)-A(空白)]×100%计算各组细胞存活率。

1.6.5 qRT-PCR检测 将BSR-T7/5细胞接种到24孔板中，分组同1.6.4，每组设置3个复孔。转染质粒后，按MOI=1的剂量接种SFTSV，分别在接毒后的0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h收集细胞和上清，反复冻融3次后提取病毒RNA，利用qRT-PCR标准曲线法定量检测病毒核酸载量并绘制病毒复制曲线。

2 结 果

2.1 SFTSV Gn三级结构模型预测 将SFTSV Gn氨基酸序列导入SWISS-MODEL后，平台自动匹配以5y11.1A[9]晶体结构为模板对SFTSV Gn进行同源建模,序列相似性为99.69%。拉氏图(图1B)显示93.6%的残基位于允许区域，5.6%的残基位于额外允许区域，表明该模型合理性较好，确定了模型的可靠性。将输出的模型在PyMOL软件上进行分析，分别将Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ子结构域用红色、黄色和绿色表示，并用蓝色箭头标示发生突变的第323位氨基酸(图1A)。

A：Gn头域三级结构预测模型B：预测模型拉氏图图1 Gn头域三级结构预测模型及其拉氏图Fig.1 Tertiary structure prediction model of Gn head domains and Ramachandran plot

2.2 真核表达载体的构建与鉴定 扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后分别可在约1.0 kb、0.8 kb(图2A)及1.7 kb(图2B)处见单一条带，与预期目的片段大小一致。目的基因与载体pcDNA3.1(+)无缝克隆连接后构建完成的重组质粒用Hind Ⅲ/XbaⅠ双酶切后在凝胶电泳约1.7 kb和5.3 kb的位置各有一条带(图2C)，且测序结果经比对与预期完全一致，证明质粒pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)构建成功。

注：A为扩增Gn(I323V)的上下游片段，1为上游片段Gn1，2为下游片段Gn2；B为扩增的目的片段，1为Gn，2为Gn(I323V)；C为重组质粒双酶切电泳图，1为 pcDNA3.1(+)-Gn，2为 pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)。图2 真核表达载体的构建与鉴定Fig.2 Construction and identification of eukaryotic expression vectors

2.3 检测SFTSV Gn在BSR-T7/5细胞中的表达 重组质粒及空载体转染BSR-T7/5细胞48 h后间接免疫荧光(图3A)及Western Blot(图3B)检测结果如图所示。转染pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)的BSR-T7/5细胞质内可见特异性绿色荧光，对照组和转染空载体组均未检测到荧光。转染pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)组在约61 kDa处均有特异性条带，与预期的Gn蛋白大小一致，而细胞对照组和转染空载体组未见此条带，认为SFTSV Gn在BSR-T7/5细胞中成功表达。

放大倍数：200×(比例尺50 μm)A：间接免疫荧光检测结果 B：Western Blot检测结果图3 重组质粒转染BSR-T7/5细胞鉴定结果Fig.3 Identification of BSR-T7/5 transfected with recombinant plasmids

2.4 CCK-8检测表达SFTSV Gn对BSR-T7/5细胞活性的影响 根据吸光度计算的各组细胞存活率如图4，转染真核表达载体pcDNA3.1(+)-Gn组和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)组的细胞存活率低于转染空载体组(t1=2.80,P<0.05;t2=7.47,P<0.01)，且两组之间的细胞存活率差异具有统计学意义(t=4.60，P<0.01)。

注：① P<0.05，② P<0.01，③ P<0.001。图4 BSR-T7/5细胞表达Gn后细胞活性检测Fig.4 Cell activity detection in BSR-T7/5 cells expressing Gn

2.5 qRT-PCR检测过表达SFTSV Gn对病毒复制的影响 利用qRT-PCR测定表达Gn及Gn(I323V)后不同时间点病毒RNA含量并绘制病毒复制曲线，结果如图5，空白组的病毒增殖速率最快，转染空载体pcDNA3.1(+)组和转染pcDNA3.1(+)-Gn组的病毒复制动力学特征相似，无明显差异；而转染pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)组的病毒增殖速率明显低于转染pcDNA3.1(+)-Gn组。

图5 病毒复制曲线Fig.5 Proliferation curve of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus

2.6 Western Blot检测SFTSV Gn对细胞自噬的影响 重组质粒及空载体转染BSR-T7/5细胞48 h后，Western Blot检测结果如图6，与空白对照组相比，p62与LC3 Ⅱ表达量均增多(t1=5.460，t2=22.10，t3=7.94，t4=28.08，t5=16.44，t6=20.59，均P<0.05)；与转染空载体组相比，除转染pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)组的LC3 Ⅱ外，p62与LC3 Ⅱ表达量均增多(t7=18.07，t8=7.60，t9=6.85，均P<0.05)；表达Gn组的p62与LC3 Ⅱ表达量均多于表达Gn(I323V)组(t10=7.35，t11=5.79，均P<0.05)。

A：自噬相关蛋白Western Blot图，B：p62蛋白相对表达量，C：LC3B Ⅱ蛋白相对表达量注：①P<0.05，②P<0.01，③P>0.05。图6 自噬相关蛋白表达水平Fig.6 Expression of autophagy related proteins

3 讨 论

SFTSV是引起SFTS的病原体，该病可引起发热、血小板减少、胃肠道及神经系统症状等。自2009年被发现以来，我国25个省份相继报道了SFTS病例，且每年呈上升趋势[16]。然而该病目前尚无公认的特异性治疗方法和药物，更无批准的人和动物的有效疫苗，且发病机制以及SFTSV与宿主细胞的相互作用机制尚不清楚。因此，构建表达Gn及Gn(I323V)的真核表达载体从而研究其与细胞的相互作用机制和对病毒复制的影响，进一步确定该氨基酸突变的生物学意义，为研究SFTSV Gn的结构和功能以及抗病毒药物有效靶点的筛选奠定基础。

既往研究结果表明，Gn和Gc可能是SFTSV诱导保护性免疫最有效的抗原[17]。Wu等[10]提出的在SFTSV表面的锚定模型证实Gn是理想的疫苗靶点。且将表达SFTSV各蛋白的质粒接种于干扰素受体敲除小鼠后，Gn相比于Gc可诱导较高的中和抗体水平且对SFTSV感染有更好的保护作用[18]。BSR-T7/5细胞可稳定表达T7 RNA聚合酶[19]，进而保证Gn蛋白的高效表达。同源重组克隆技术无需考虑插入片段自身携带的酶切位点可定向克隆至任意载体的任意位点，不依赖于连接酶和磷酸酶，具有省时、高效的优点[20]。

本研究采用同源建模的方法预测SFTSV Gn的蛋白结构，确定了突变氨基酸位点的位置，成功构建并在BSR-T7/5细胞中表达真核表达载体pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)，对关键氨基酸位点进行功能验证。qRT-PCR结果显示过表达Gn对病毒复制无明显影响，但表达Gn(I323V)后细胞增殖速率降低。CCK-8及Western Blot结果表明表达Gn和Gn(I323V)可不同程度地降低BSR-T7/5细胞存活率，且除转染pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)组的LC3 Ⅱ外，p62与LC3 Ⅱ表达量均不同程度增多。表明SFTSV Gn可能是通过调控自噬通量来影响细胞活性且第323位氨基酸突变(I323V)对宿主细胞和病毒复制有影响。p62是一种多功能结合蛋白，已被发现调节自噬、细胞存活、细胞死亡、氧化应激、DNA修复和炎症等多种细胞过程[21-24]，提示SFTSV Gn可能还与氧化应激、DNA修复和炎症等通路相关，有待进一步研究。

对同属布尼亚病毒科的汉坦病毒(hantann virus, HTNV)研究结果表明，HTNV的糖蛋白可通过控制自噬通量来抑制宿主细胞的先天免疫反应并且可能抑制病毒的复制[25]。本研究结果表明过表达Gn并不影响病毒的复制，但发现表达SFTSV Gn后细胞自噬流明显被抑制且细胞存活率降低，与其研究结果一致，提示可进一步加入自噬调控的诱导剂和抑制剂，从而提供更坚实的实验依据。

反向遗传技术是研究RNA病毒分子生物学、发病机制、疫苗和抗病毒药物的有效工具，可拯救出含有定点突变的毒株进而研究突变所引起的病毒生物学功能的改变。目前已有研究成功构建SFTSV反向遗传系统[26-28]，但本课题组多次尝试未能成功构建SFTSV反向遗传系统，因此未能从病毒水平上研究Gn第323位氨基酸突变对SFTSV糖蛋白功能的影响。

综上所述，SFTSV Gn可能是通过抑制自噬流从而影响细胞活性且第323位氨基酸突变对宿主细胞和病毒复制有影响，为进一步研究SFTSV Gn的结构与功能以及抗病毒药物提供新的理论依据。

利益冲突：无