高效液相色谱法测定化妆品中对羟基苯甲酸甲酯含量的不确定度评定

曹蓉蓉，刘燕，陈浩

(榆林市药品检验所，陕西榆林 719000)

对羟基苯甲酸酯类又称尼泊尔金酯，为白色结晶粉末，具有抗菌能力好、用量小、毒性低，pH 应用范围广等特点[1-2]，为化妆品中常用防腐剂，能有效抑制化妆品中微生物滋生，防止营养物质被破坏，具有延长产品保质期的作用。但是长期吸入此类物质对身体有害，对眼睛、皮肤、上呼吸道等有刺激作用[3-4]。因此我国化妆品卫生规范中对对羟基苯甲酸酯类防腐剂有最高限量的规定。

笔者按照《化妆品安全技术规范》(2015 年版)中对羟基苯甲酸酯含量测定方法[5]和国家计量技术规范JJF 1059.1—2012 《测量不确定度评定与表示》[6]中不确定度评定的基本程序，结合实际检测工作条件和相关文献[7-16]，采用高效液相色谱法测定对羟基苯甲酸甲酯含量，通过不确定度来源分析，对高效液相色谱测定化妆品中对羟基苯甲酸甲酯含量的不确定度进行了评定，并对每个影响因素进行数据计算及分析，得出最终不确定度结果，为评价含量测定的可靠性提供科学依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱：Agilent 1260 型，DAD 检测器，美国安捷伦科技有限公司。

天平：(1) BSA224S 型，分度值为0.1 mg，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；(2) MS205DU 型，感量为0.01 mg，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

超声波清洗器：AS5150A 型，天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

自动纯水蒸馏器：LHP-18-2 型，重庆力德高端水处理设备研发有限公司。

酸度计：PB-21 型，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

对羟基苯甲酸甲酯标准物质：纯度为99.8%（质量分数），扩展不确定度为0.3%(k=2)，批号为G128079，德国Dr. Ehrenstorfer 有限公司。

甲醇、乙腈：色谱纯，西格玛奥德里奇有限公司。

磷酸二氢钠、氯化十六烷三甲胺、磷酸：优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

化妆品样品：某美白保湿乳液，市售。

1.2 色谱条件

色 谱 柱：C18柱(250 mm×4.6 mm，10 μm，美国安捷伦科技有限公司)；进样体积：5 μL；经检测波长：254 nm；柱温：22 ℃；流动相：0.05 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇-乙腈溶液(体积比为50∶35∶15)，添加氯化十六烷三甲胺至浓度为0.002 mol/L，并用磷酸调pH 至3.5，流量为1.5 mL/min。

1.3 溶液配制

对羟基苯甲酸甲酯标准储备溶液：准确称取对羟基苯甲酸甲酯标准物质16.07 mg 于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至标线，摇匀。

对羟基苯甲酸甲酯系列标准工作溶液：精密量取对羟基苯甲酸甲酯标准储备液2 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至标线，即得1#标准溶液；量取对羟基苯甲酸甲酯标准储备液1 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至标线，作为2#标准溶液；量取2#标准溶液5 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至标线，作为3#标准溶液。以此类推，逐级移取上级标准溶液5 mL 于10 mL 容量瓶中，稀释至标线，即得对羟基苯甲酸甲酯系列标准工作溶液。

1.4 样品处理

准确称取1.0 g 样品，置于具塞比色管中，水浴去除乙醇等挥发性有机溶剂，加甲醇至10 mL，振摇，超声提取15 min，离心。经0.45 μm 滤膜过滤，滤液作为样品溶液。

1.5 实验方法

分别精密移取对羟基苯甲酸甲酯标准溶液、样品溶液各5 μL，按1.2 色谱条件进样测定，利用外标法以色谱峰面积计算样品溶液中对羟基苯甲酸甲酯含量。

2 数学模型及测量不确定度的来源

2.1 数学模型

对羟基苯甲酸甲酯含量的计算见下式：

2.2 测量不确定度来源

2.2.1 对羟基苯甲酸甲酯标准物质引入的不确定度

(1)对羟基苯甲酸甲酯标准物质纯度引入的不确定度。从标准物质证书上查得对羟基苯甲酸甲酯标准物质的纯度为99.89%(质量分数)，扩展不确定度U=±0.3%(k=2)，则相对标准不确定度：

2.2.2 标准曲线拟合引入的不确定度

(1)标准溶液配制过程量器引入的不确定度。温度变化引入的相对不确定度计算同“2.2.1 项下”，则环境温度引入的相对标准不确定度：

对羟基苯甲酸甲酯系列标准溶液配制过程分别使用了10 mL 容量瓶6 次，1、2 mL 移液器各1 次，5 mL 移液器4 次，3 种量器的容量允差及合成相对标准不确定度见表1。

表1 量器引入的相对标准不确定度

将表1 中各不确定度分量合成，得玻璃量器引入的相对标准不确定度：

式中：s——残差标准偏差；

B1——线性方程斜率；

p——平行测定次数,p=4；

n——系列标准工作溶液的浓度点数，n=12；

ρy——样品溶液中对羟基苯甲酸甲酯的质量浓度，μg/mL；

对6 种不同浓度标准溶液分别平行测定2 次，计算结果见表2。

表2 标准曲线拟合实验数据

将表2 测定数据代入式(2)、(3)计算，得到标准曲线拟合引入的标准不确定度：

对样品溶液进行4 次测定，由标准曲线计算得到样品中对羟基苯甲酸甲酯质量浓度为203.28 μg/mL，则标准曲线拟合引入的相对标准不确定度：

2.2.3 样品处理引入的不确定度

称 样2 次，称 样 质 量(mx) 分 别 为1 005.2、1 001.2 mg，采用减量法称重，称量引入的不确定度计算两次，则相对标准不确定度：

2.2.4 高效液相色谱仪引入的不确定度

2.2.5 测量重复性引入的不确定度

对一样品重复测量6 次，精密称取6 份样品各测定2 次(n=6，N=2)，结果见表3。

表3 样品色谱峰面积重复性测定结果

由表3 数据计算得重复测定样品引入的相对不确定度：

2.3 样品测定结果

由线性方程计算出样品中对羟基苯甲酸甲酯的质量浓度，代入式(1)可得样品中对羟基苯甲酸甲酯的含量为2 026.32 μg/g。

2.4 不确定度的合成

以上各不确定分量互不相关，则样品中对羟基苯甲酸甲酯含量的相对标准不确定度：

2.5 扩展不确定度

取包含因子k=2(近似95%置信概率)，则对羟基苯甲酸甲酯含量扩展不确定度U=ku(x)=36.20 μg/g。

2.6 结果表示

对羟基苯甲酸甲酯的含量为(2 026.32±36.20)μg/g。

3 结语

通过分析不确定度的来源，发现5 方面不确定度因素可以影响化妆品中对羟基苯甲酸甲酯的含量测定结果，其中对羟基苯甲酸甲酯标准物质称量和系列标准溶液配制过程是测量不确定度的主要来源，而样品测量重复性对不确定度影响最小。试验结果表明，由于标准工作溶液试验点数增加、样品重复测定次数较多以及仪器的稳定状态较好，故上述因素对合成不确定度的影响较小。在标准溶液的配制过程中，由于溶液稀释采用量器较多，导致量器校准引入的不确定度最大。实验时可以通过增加标准物质称样量、对照品纯度校正、减少溶液稀释步骤、增加仪器灵敏度等方法降低测量不确定度的影响。