恩替卡韦对慢性乙型肝炎外周血Th9/Treg 的影响

郭艳 李华铭 王宇芳 李春霞 刘肄辉

1.杭州市第三人民医院消化科，浙江杭州 310009；2.杭州市红十字会医院消化肝病科，浙江杭州 310003

近年来，CD4+T 淋巴细胞的主要亚群，如辅助性T 淋巴细胞（helper T cells，Th）1、Th2 和Th17 已被证明在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）诱导的肝脏炎症的发展中发挥重要作用[1]，其中调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）和Th17 细胞在慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）中的抗炎和促炎作用已得到证实，且Treg/Th17 平衡是调节机体免疫功能变化的重要指标[2,3]。Th9 是CD4+T 淋巴细胞亚群新成员，被认为在CHB 中具有促炎作用[4]，其在分化与功能上与Treg 细胞具有一定的相关性，目前研究认为Treg 细胞在CHB 中主要起免疫抑制作用[5]，但Th9/Treg 与慢性乙型肝炎的相关研究报道较少。本研究发现Th9/Treg 与CHB 炎症反应有关[6]，抗病毒治疗作为目前CHB 的主要治疗手段能否通过对Th9/Treg 的作用而影响疗效尚不清楚，本研究观察恩替卡韦（entecavir，ETV）对Th9/Treg 的影响及疗效的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集杭州市第三人民医院2019 年1 月至2020年1 月符合抗病毒治疗指征的CHB 患者40 例，诊断及抗病毒指征符合《慢性乙型肝炎防治指南2015年版》[7]，所有患者未接受过抗病毒治疗或免疫调节治疗。排除标准：①合并甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒等；②排除合并脂肪性、酒精性和遗传代谢性肝病、失代偿性慢性肝病及自身免疫相关的其他疾病；③无心脑血管、肝、肾和造血系统重大疾病及精神病患者；④排除妊娠或哺乳期妇女。本研究经杭州市第三人民医院伦理委员会批准同意（审批号：2022KA035），所有患者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

符合抗病毒治疗指征的CHB 患者予恩替卡韦（正大天晴药业集团股份有限公司，国药准字H20100019）0.5mg/d 抗病毒治疗，观察时间24 周，治疗前后检测患者的血清肝功能、乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（hepatitis B virus deoxyribonucleic acid，HBV-DNA）、外周血Th9、Treg 等指标。治疗24 周后，根据HBV-DNA 是否转阴分为HBV-DNA 转阴组及HBV-DNA 未转阴组，并观察外周血Th9、Treg水平变化。

1.3 主要仪器及试剂

HBV 血清标志物采用美国雅培I-2000 全自动免疫发光分析仪进行化学发光法定量检测，丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase，ALT）采用日本日立全自动7180 生化仪进行全自动生物化学分析检测，HBV-DNA 采用美国ABI 公司ABI7000 型全自动荧光定量PCR 系统进行实时荧光定量PCR 检测。流式细胞仪（美国，Thermo Attune）。

1.4 实验方法及步骤

1.4.1 流式细胞仪检测外周血Th9 细胞（CD3+CD8-IL-9+）取125μl 抗凝血至流式管中，加入125μl不含血清的培养基和1μl PMA/IonomycinMixture 和1μl BFA/MonensinMixture，取125μl 抗凝血和125μl不含血清的培养基作为对照，混匀，37℃孵育4～6h，每隔1～2h 取出震荡混匀，从样本管和对照管中取100μl 细胞悬液至新的流式管中，加入5μl anti-Human CD3 和5μl anti-Human CD8α，震荡混匀，室温避光孵育 15min，每管加入 100μl FIX&PERMMedium A，震荡混匀，室温避光孵育15min，每管加入2ml 预冷1×Flow cytometry staining buffer，300×g离心5min，弃上清，每管加入100μl FIX &PERM Medium B 和5μl IL-9 Monoclonal antibody（MH9D1），震荡混匀，室温避光孵育15min，每管加入2ml 1×Flow cytometry staining buffer，300×g离心5min，弃上清，每管加入500μl 1×Flow cytometry staining buffer 重悬，上机检测。

1.4.2 流式细胞仪检测外周血Treg 细胞（CD4+CD25+Foxp3+）在流式管中加入人抗凝血100μl，加入5μl anti-Human CD4，荧光素5-异硫氰酸酯（Fluorescein isothiocyanate isomer I，FITC）和5μl anti-Human CD25，别藻蓝蛋白（Allophycocyanin,APC），涡旋震荡混匀，室温避光孵育15min，每管加入2ml 1×FCM lysing solution 工作液，涡旋震荡混匀，室温避光孵育15min。室温下300×g离心5min，弃上清，每管加入2ml 1×Flow cytometry staining buffer，涡旋震荡混匀，室温下 300×g离心 5min，弃上清，每管加入 1ml 1×Fixation/Permeabilization 工作液，涡旋震荡混匀，室温避光孵育30～60min，每管加入2ml 1×Permeabilization buffer，室温下300×g离心5min，弃上清，用100μl 1×Permeabilization buffer 重悬沉淀，加入5μl anti-Human Foxp3，藻红蛋白（phycoerythrin，PE），或5μl Rat IgG2a Isotype control，PE，震荡混匀，室温避光孵育至少30min，每管加入2ml 1×Permeabilization buffer，室温下300×g离心5min，弃上清，每管加入500μl 1×Flow cytometry staining buffer 重悬，上机检测。

1.5 统计学方法

应用SPSS 26.0 统计学软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验，组内均值比较采用成对样本t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

CHB 患者40 例，男23 例，女17 例，平均年龄（42.72±9.18）岁，HBV-DNA（6.35±1.08）IU/ml。

2.2 ETV 抗病毒治疗前后外周血各项指标的变化

治疗后ALT 水平、HBV-DNA 载量、Th9 频数、Treg 频数、Th9/Treg 比值均较治疗前明显下降（P<0.05），见表1。

表1 ETV 治疗前后的外周血各项指标变化（ ）

表1 ETV 治疗前后的外周血各项指标变化（ ）

2.3 ETV 治疗后ALT 复常与未复常患者的外周血各项指标变化

治疗24 周后ALT 复常33 例，未复常7 例，ALT复常者ALT 水平、Th9 频数、Th9/Treg 比值均低于ALT 未复常者，Treg 频数高于 ALT 未复常者（P<0.05），见表2。

表2 ETV 治疗后ALT 复常与未复常患者的外周血各项指标变化（ ）

表2 ETV 治疗后ALT 复常与未复常患者的外周血各项指标变化（ ）

2.4 ETV 治疗后HBV-DNA 转阴与未转阴患者的外周血各项指标变化

治疗24 周后HBV-DNA 转阴34 例，未转阴6例，HBV-DNA 转阴患者的Th9 频数、Th9/Treg 比值低于未转阴者，Treg 频数高于未转阴者（P<0.05），见表3。

表3 ETV 治疗后HBV-DNA 转阴与未转阴患者的外周血各项指标变化（ ）

表3 ETV 治疗后HBV-DNA 转阴与未转阴患者的外周血各项指标变化（ ）

3 讨论

目前，核苷（酸）类似物（nucleotide analogues，NAs）已广泛用于临床治疗 CHB，它们在抑制HBV-DNA 复制、复常ALT 水平、改善组织学和患者预后方面具有重要作用。NAs 是病毒复制的高效抑制剂，可选择性抑制HBV-DNA聚合酶的活性[8-10]。ETV 是临床实践指南推荐的一线抗病毒药物[11]，在抑制HBV-DNA 复制和延缓疾病进展方面具有较好的治疗效果[12,13]。

研究证实，Th9/Treg 与CHB 炎症反应有关[6]。Th9 是以分泌白细胞介素-9 为特征的CD4+T 细胞亚群，有研究认为其参与CHB 的发病机制[14]，而另一类CD4+T 细胞亚群Treg 细胞被认为通过抑制各种类型的细胞，包括CD4+T 和CD8+T 细胞等，在CHB 免疫耐受的发展和维持中发挥关键作用[15,16]。目前多数研究认为Th17/Treg 参与CHB 的发病机制，与肝脏炎症密切相关[17-19]。NAs 抗病毒治疗有利于Th17/Treg 失衡的恢复，从而有利于CHB 核心抗原血清转化甚至CHB 表面抗原清除[20-22]。但Th9/Treg 在CHB 中的变化及抗病毒治疗对其影响的相关研究较少，本文前期研究发现Th9/Treg 与CHB 炎症反应有关[6]，ETV 抗病毒治疗能降低CHB患者外周血Th9 频数，治疗早期Th9 频数下降的患者HBeAg 血清学转换率更高[23]。本研究发现CHB经ETV 抗病毒治疗24 周后，随着ALT、HBV-DNA水平的下降，外周血Th9 细胞频数、Treg 频数均下降，Th9/Treg 比值下降，提示抗病毒治疗对细胞免疫功能有影响，具体的机制可能与ETV 强大的抗病毒作用有关，且随着高载量病毒的抑制，肝脏炎症的始动因素得到抑制，Th9 及Treg 水平趋向正常，人体免疫功能得以恢复，推测ETV 也可能具有细胞免疫直接调节功能。

ETV 抗病毒治疗有利于恢复Th9/Treg 的失衡，持续抑制病毒复制，甚至完全清除。Yan等[13]研究认为ETV 具有较强的抗病毒作用，但免疫调节作用较弱，对外周血Th9、Treg 无影响。进一步研究发现，Treg可能对Th9 具有免疫抑制作用，前期研究证实Th9 与ALT 呈正相关，Th9 起到促炎作用，Treg 与ALT 呈负相关，发挥抗炎作用[6]，Th9 与Treg 在功能上具有拮抗作用；治疗24 周后HBV-DNA 未转阴患者中Treg细胞频数低可能打破免疫耐受。Th9/Treg 比值低提示ALT 复常率、HBV-DNA 转阴率高，在一定程度上可预测CHB 疗效。由于观察时间短，HBeAg 血清学转换率及HBsAg 转阴率等远期疗效有待进一步观察。

值得探讨的是治疗前后外周血Th9、Treg 水平并未表现出相反的趋势，而均表现为频数下降，Th9/Treg比值亦降低，因此推测Th9/Treg 可能在CHB 不同阶段动态变化，从而出现肝脏免疫耐受或免疫激活状态。本研究对ETV 影响CHB 外周血Th9/Treg 进行了初步观察，由于样本量少，未能进行长时间动态观察，结论尚待进一步证实，外周血CD4+T 细胞亚群在CHB中很可能存在一种动态平衡维持CHB 的不同状态，其与CHB 的远期预后是否有关、是否影响HBeAg 转换甚至HBsAg 清除等尚需深入研究。

综上所述，ETV 抗病毒治疗可降低外周血Th9、Treg 水平，降低Th9/Treg 比值，与疗效相关。