不同级别胚胎玻璃化冷冻时长对复苏周期临床结局的影响

张艳茹 杜娟 高文怡 李采霞

中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院生殖中心，江苏无锡 214000

胚胎冷冻在辅助生殖中发挥十分重要的作用，它不仅可提高累计妊娠率和单个周期胚胎利用率，还可降低卵巢过度刺激及多胎妊娠的发生率[1]。玻璃化冷冻又称无冰晶技术，在高浓度冷冻保护剂中发生急速冷却，液态变固态的过程中不形成冰晶从而起到保护作用[2]。有文献报道，胚胎短期玻璃化冷冻、解冻移植后对临床结局没有影响[3]。胚胎玻璃化冷冻时间的延长对胚胎后续发育潜力及临床结局有无影响目前报道较少。不同级别胚胎的玻璃化冷冻时长对妊娠结局是否产生影响以及在冷冻保存中该如何调整是目前临床关注的重点。本文针对解冻复苏不同级别胚胎和冷冻时长进行分类，分析不同级别胚胎的冷冻时长对妊娠结局的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2016 年1 月至2021 年12 月于中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院生殖中心行冻融胚胎移植病例。纳入标准：①女方年龄≤37 岁；②移植周期≤3 个；③移植相同级别胚胎。排除标准：①解冻后无可移植胚胎者；②接受遗传学诊断/胚胎植入前遗传学筛查者。

1.2 胚胎冷冻与复苏

1.2.1 胚胎评价标准 卵裂期胚胎采用美国辅助生殖技术协会（SART）胚胎评分系统：根据胚胎的整体外观情况，即细胞数量、碎片比例、对称性三个指标。卵裂期胚胎划分为4 级：1 级胚胎是指卵裂球对称，胞质正常，没有碎片；2 级胚胎是指卵裂球对称或不对称，胞质正常，碎片比例<10%；3 级胚胎是指卵裂球对称或不对称，碎片比例11%～25%；4 级胚胎是指卵裂球对称或不对称，碎片比例>25%。选择4 个细胞以上的1～3 级可利用胚胎进行冷冻[4]。卵裂期中1 级和2 级为优质胚胎。囊胚采用Gardner 评分系统[5]。根据囊胚腔的大小和孵化情况分为6 期：1 期早期囊胚有腔室，腔体积<总体积的1/2；2 期囊胚腔体积≥胚胎总体积的1/2；3 期完全扩张囊胚，腔体积占据胚胎的总体积；4 期扩张囊胚，囊胚腔完全充满胚胎，胚胎总体积变大，透明带变薄；5 期正在孵出的囊胚，囊胚的一部分从透明带逸出；6 期孵出的囊胚全部从透明带中逸出。内细胞团（inner cell mass，ICM）评分：A.细胞数目多，结合紧密；B.细胞数目偏少，结合尚紧密；C.细胞数目很少，结合松散。滋养外胚层TE 评分：A.上皮细胞层由较多的细胞组成，结构致密；B.上皮细胞层由不多的细胞组成，结构松散；C.上皮细胞层由稀疏的细胞组成，选择3BC以上囊胚进行冷冻移植。本文中胚胎级别的划分是指胚胎解冻后移植前的评分。

1.2.2 胚胎冷冻复苏方法 采用日本KITAZATO 试剂在常温下进行玻璃化冷冻。冷冻液在室温下平衡30min，将胚胎吸取放入平衡液10min，再转入玻璃化冷冻液中平衡，90s 内将胚胎移至冷冻载杆上并迅速放入液氮中保存。囊胚冷冻前进行激光皱缩。胚胎复苏采用日本KITAZATO 试剂进行玻璃化解冻。将玻璃化解冻液1 放入37°培养箱中平衡30min，玻璃化解冻液2、3、4 在室温下平衡30min。胚胎复苏时，将有胚胎的Cryotop 载杆前段迅速浸入预温的解冻液1 中1min，解冻液2 中3min，解冻液3 中5min，解冻液4 中1min，最后放入事先预温好的BM（10%血清浓度）液中。直接冷冻D3 胚胎或继续培养2～4d囊胚。卵裂期胚胎冷冻标准每管≤2 枚，囊胚期每管1 枚。卵裂期胚胎复苏后0.5h 进行移植，囊胚期胚胎复苏后至少1h 后进行移植。

1.3 内膜准备方案

①自然周期：适用于月经规律、排卵正常且内膜形态较好的患者；②激素替代周期：适用于月经不调、无排卵、多囊卵巢综合征患者；③刺激周期：适用于月经周期长、排卵障碍、子宫内膜厚或有雌激素禁忌证患者。当内膜厚度≥8mm 时，雌激素（estradiol，E2）>750pmol/L 时，肌肉注射黄体酮，移植后继续进行黄体支持。

1.4 统计学方法

应用SPSS 24.0 统计学软件对数据进行分析和处理，正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5 组患者的临床基本资料比较

共纳入2210 个冻融周期，根据患者胚胎冷冻时间分为五组。第1 组：冻存时间≤180d；第2 组：冻存时间180～<360d；第3 组：冻存时间360～<720d；第4 组：冻存时间720～<1080d；第5 组：冻存时间≥1080d。5 组患者的年龄、体质量指数（body mass index，BMI）、内膜厚度比较，差异无统计学意义（P>0.05）；不孕年限和周期数受冻存时间的影响，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 5 组患者的临床基本资料比较（ ）

2.2 卵裂期1 级胚胎不同冻存时间组的临床妊娠结局比较

不同冻存时间解冻周期中1 级胚胎的妊娠率和种植率比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中第1 组的妊娠率、种植率明显高于其他4 组，流产率和活产率比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 卵裂期1 级胚胎不同冻存时间组的临床妊娠结局比较[%（n/n）]

2.3 卵裂期2 级胚胎不同冻存时间组的临床妊娠结局比较

不同冻存时间解冻周期中2 级胚胎的妊娠率、种植率比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中第1、4、5 组的妊娠率、种植率比较，差异有统计学意义（P<0.05）；流产率和活产率比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

表3 卵裂期1 级胚胎不同冻存时间组的临床妊娠结局比较[%（n/n）]

2.4 卵裂期3 级胚胎不同冻存时间组的临床妊娠结局比较

不同冻存时间解冻周期中3 级胚胎的妊娠率和种植率比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中第5 组的妊娠率、种植率明显高于其他4 组；流产率和活产率比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表4。

表4 卵裂期3 级胚胎不同冻存时间组的临床妊娠结局比较[%（n/n）]

2.5 囊胚不同冻存时间组的临床妊娠结局比较

不同冻存时间解冻周期囊胚的妊娠率和种植率比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中第1 组的妊娠率、种植率高于其他4 组；流产率和活产率比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表5。

表5 囊胚不同冻存时间组的临床妊娠结局比较[%（n/n）]

3 讨论

自1983 年人类首例冻融胚胎移植成功妊娠并活产[4]，胚胎冷冻技术的发展日趋成熟，现已广泛用于临床，在辅助生殖技术中不可或缺。玻璃化冷冻技术因其操作简便、耗时短，可减少对胚胎的机械损伤，有利于保存胚胎的发育潜力，从而提高存活率而被广泛使用[5]。细胞在液氮中酶活力受到抑制，代谢处于停滞状态，理论上可无限期保存[6]。近年来，有学者指出胚胎的冷冻保存可能会影响基因的稳定性。二甲基亚砜作为玻璃化冷冻的保护剂，与细胞内蛋白质发生不可逆结合，可能会对胚胎有一定毒性[8]。因此，胚胎冷冻保存的安全性、冷冻时间的延长对胚胎质量及妊娠率的影响一直是本领域持续关注的问题。

本研究对冻胚移植的2210 个周期，按照胚胎级别进行分类划分研究，比较不同冻存时间胚胎的临床妊娠率、种植率、活产率和流产率。本研究结果显示，冷冻时间≤180d 组卵裂期1 级、2 级胚胎和囊胚期胚胎妊娠率、种植率最高（P<0.05），且优质胚胎种植率、妊娠率较高。有研究表明，胚胎短期保存（≤6 个月）可获得较高的复苏率及临床妊娠率[9,10]，与本研究观点一致。有文献指出，冷冻胚胎保存时间1～2 个月内解冻移植有助于提高妊娠率，长期在液氮中保存会降低胚胎存活率[11]。目前有文献报道提示，胚胎冷冻保存时间长短不影响胚胎复苏后妊娠率、种植率、活产率。2010 年Zech等[12]研究发现，胚胎冷冻保存时间的长短并不影响胚胎的妊娠率、种植率、活产率。2016 年Kasai等[13]研究分析了786 个卵裂期胚胎冻融周期，发现低温下冻存时间不影响临床妊娠率和活产率。2020 年Testart等[14]分析囊胚的冻融周期，冻存时间的长短并不会影响胚胎的复苏率。2021 年Riggs等[15]研究认为，延长玻璃化冷冻胚胎保存时长，不会对复苏后移植的临床结局和新生儿结局带来负面影响[15]。本研究中2 级胚胎第1 组的妊娠率、种植率比较，差异有统计学意义（P<0.05），而第4、5 组的妊娠率、种植率也高于其他组，此外3 级胚胎中第5 组比较，差异有统计学意义（P<0.05），说明冻存时间对妊娠率和种植率没有影响。

综上所述，优质胚胎的短期保存（<6 个月）可提高临床妊娠率。冻存时间可能影响胚胎的种植率、妊娠率，在身体符合移植条件的情况下，鼓励在取卵后半年内进行择优移植，有利于提高临床妊娠率。