线粒体功能紊乱在糖尿病视网膜病变中作用的研究进展△

王紫郦 魏婷婷 谢田华 蔡季平 姚 勇

糖尿病视网膜病变(DR)作为糖尿病的常见并发症，是导致中老年人视力下降的主要原因之一；其中，约1/3的糖尿病患者发生 DR,1/10的患者被威胁到视力[1-2]。根据严重程度DR可分为：轻度非增生型 DR (NPDR)、中度 NPDR、重度 NPDR 和增生型 DR，增生型DR中存在异常的新生血管。同时，在视网膜病变的任一阶段，随着黄斑的渗出和水肿，患者也可能发展为糖尿病性黄斑水肿[3]。DR 的病理生理包括视网膜毛细血管基底膜增厚、视网膜血管通透性增加、组织缺血和各种血管活性物质的释放，从而促进新生血管的形成[4]。鉴于血管内皮生长因子(VEGF)在 DR 和糖尿病性黄斑水肿发病机制中的作用，抗 VEGF 疗法已被证明可以防止异常血管生长的形成并减缓糖尿病眼病的进展[5]。然而，有研究表明，玻璃体内注射抗 VEGF 药物与高血压加速、蛋白尿恶化、肾小球疾病、血栓性微血管病和慢性肾功能下降有关[6]。成本效益研究表明，持续抗VEGF治疗对许多患者来说可能不可持续[7]。因

此，寻找新的治疗靶点和药物迫在眉睫。目前， DR 的发病机制尚不明确，氧化应激已被证实是DR发病机制的关键因素之一。许多分子机制与诱导氧化应激有关，包括葡萄糖氧化、抗氧化酶受损、高血糖引起的代谢异常和线粒体损伤等[4,8]。线粒体是蛋白杆菌起源的真核细胞器[9]，是细胞动力源，执行一系列核心新陈代谢过程，并参与细胞凋亡和衰老过程的调节。线粒体DNA (mtDNA) 编码少数线粒体蛋白，是氧化磷酸化 (OXPHOS) 复合体的关键部分，其产生的ATP作为细胞化学能量的来源，因此，对线粒体和生物体的健康必不可少[10]。线粒体还可以协调细胞对应激的反应，如营养缺乏、氧化应激、DNA损伤和内质网应激反应。研究表明，线粒体产生代谢副产物，如活性氧 (ROS) 和氨，并具有清除或利用废物的机制[11]。目前已经发现，线粒体质量和活性的下降与线粒体动力学(如线粒体融合和裂变)的失调有关，并参与一系列人类相关疾病的进展[12-13]。本文就近年来线粒体功能紊乱在 DR 发病中的研究进展作一综述，为 DR 的发病机制和治疗方案提供新的思路。

1 ROS蓄积与线粒体功能紊乱

在高血糖条件下，视网膜中ROS大量产生，诱导氧化应激反应，损害线粒体的结构和功能，进而引起线粒体功能紊乱，进一步诱导视网膜毛细血管细胞凋亡[14]。ROS的产生主要分为酶和非酶两个途径，其中，还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶 (NOX) 和线粒体电子传递链 (ETC) 途径是其主要来源[15]。NOX 家族酶是细胞质ROS 的主要来源，而 NOX2 是一种高度调节的多蛋白膜结合酶，催化氧的单电子还原为超氧化物[16]。Kowluru等[15]研究发现，T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1 (TIAM1)-小GTP酶Rac1 (RAC1) -NOX2 信号轴在糖尿病初始阶段被激活，诱导细胞内ROS生成，导致线粒体损伤和毛细血管细胞凋亡，这表明靶向TIAM1-RAC1信号可能阻止DR早期阶段的进展。线粒体 ROS 的产生主要发生在ETC的氧化磷酸化过程中，复合物I和复合物III电子泄漏导致 1%～5% 氧以超氧自由基形式逸出，很快被氧化为过氧化氢和双原子氧。DR状态下，高循环葡萄糖增加了ETC的电子通量，复合物III活性降低，最终导致ROS生成增加[17]。高血糖条件下，线粒体中 ROS积累导致线粒体功能障碍，而 ROS 介导的线粒体缺陷导致胶质细胞中脂滴积累，脂滴可以进一步被 ROS 氧化，从而导致视网膜神经变性[18]。脂质过氧化也可以促进 ROS产生，从而促进视网膜色素上皮细胞衰老，进而促进 DR进展。

2 线粒体与抗氧化反应

细胞具有高效的抗氧化酶防御系统，但在糖尿病患者中，视网膜抗氧化酶活性降低，最终导致自由基含量增加，例如铜锌超氧化物歧化酶、锰超氧化物歧化酶 (Sod2)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶，其中 Sod2是一种线粒体基质酶[19-20]。Mishra等[21]研究发现，小鼠视网膜微血管过表达 Sod2 可以防止糖尿病引起的 DNA 甲基化和碱基错配增加，缓解小鼠 DR 进展。核因子红系2相关因子2 (Nrf2) 是氧化应激的主要调节因子，通过激活富含腺嘌呤和尿嘧啶的元件2相关基因和蛋白表达，如血红素氧合酶-1 (HO-1) 和醌氧化还原酶1 (NQO1) 增加，调节线粒体膜电位和生物发生[22]。Nrf2 活性主要由 Kelch 样 ECH 关联蛋白1 (Keap1) 调节，Keap1 与Nrf2 结合，抑制 Nrf2 活性[23]。富马酸二甲酯是一种富马酸酯，在非癌症模型中具有细胞保护和抗氧化作用，这似乎与其诱导 Nrf2通路有关，可作为治疗DR的潜在靶点[24]。Sigma-1受体 (σ1R) 是一种定位于内质网和线粒体膜的蛋白质，Wang等[23]研究发现，在没有σ1R的情况下，Nrf2 和 Keap1 的水平均会发生改变，这为 σ1R 作为调控 Nrf2-Keap1 信号通路奠定了基础。还有研究发现，硫辛酸是一种改善大鼠视网膜mtDNA 损伤和缓解 DR 的抗氧化剂，可见抗氧化反应是未来治疗DR的一个重要靶点[25]。Radhakrishnan等[8]研究认为，长链非编码RNA (LncRNA) MALAT1可能通过调控 Keap1-Nrf2 信号通路，调控 DR的抗氧化防御过程。抑制LncRNA MALAT1可保护视网膜免受氧化损伤，减缓DR发生发展过程。

3 线粒体损伤机制

线粒体超微结构显示，DR状态下，视网膜线粒体膜完整性受损，细胞色素 C泄漏到细胞质中，mtDNA 复制数减少；并且NADPH 氧化酶被激活，细胞质 ROS 的增加破坏了线粒体的完整性，加剧了自由基的恶性循环[17,19]。研究表明，视网膜微血管中约 30% 线粒体超微结构受损表现为嵴裂增大。另外，糖尿病患者视网膜中的小分子转运蛋白 Slc25a21 减少，该蛋白参与 2-氧代己二酸摄取到线粒体基质中，2-氧代戊二酸从线粒体释放到细胞质中。线粒体 Slc25a21 和 三羧酸循环底物向线粒体的转运在糖尿病患者中均低于正常水平。此外，糖尿病状态下，膜极化蛋白解偶联蛋白2 和谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基含量降低，这与DR状态下线粒体膜电位受损一致[26]。另外，DR 状态下视网膜脂质过氧化水平升高，从而损害线粒体膜[2,27]。

基质金属蛋白酶 (MMP) 是一种细胞外基质降解蛋白家族，与血管生成、血管重塑和凋亡有关[28]。MMP在 DR 的发展中具有双重作用，在疾病的早期阶段(新生血管形成前)，MMP-2和MMP-9 可能通过破坏线粒体，促进视网膜毛细血管细胞凋亡；而在疾病后期，则有助于新生血管形成[29]。高血糖激活MMP-2，导致线粒体热休克蛋白60 和连接蛋白43减少，诱导线粒体损伤和线粒体转运孔开放，细胞色素C从线粒体膜处泄漏，进而激活凋亡[30]。Zhong等[31]研究证实，活化的赖氨酸特异性去甲基化酶 1 在 MMP-9 启动子处使组蛋白3的第9位氨基酸赖氨酸低甲基化，诱导赖氨酸 9 乙酰化，促进 p65 的募集，诱导 MMP-9 激活和线粒体损伤。因此，调节赖氨酸特异性去甲基化酶 1 有可能延缓DR进展。研究表明，敲除 MMP-9 基因可以通过阻止线粒体损伤进而延缓糖尿病小鼠视网膜病变的进展[32]。组蛋白去乙酰化酶Sirtuin 1 (SIRT1) 可以通过促进核因子 kappa B (NF-κB) 的p65亚基的去乙酰化，降低转录因子的活性，抑制 MMP-9 的激活，延缓DR进展[33]。

超氧化物可以与一氧化氮 (NO) 反应生成强氧化剂过氧亚硝酸盐，过氧亚硝酸盐通过改变线粒体能量和钙稳态，促进线粒体通透性转换孔的开放，对线粒体造成不可逆的损伤，从而导致细胞凋亡[2]。钙离子(Ca2+)信号在神经元的正常功能中起关键作用，其失调可能导致神经元退化。线粒体是参与调节细胞内 Ca2+信号转导的重要细胞器之一。Haider等[34]研究发现，高糖环境下，视网膜神经元表现出线粒体钙超载，伴随着线粒体膜去极化和线粒体ROS生成增加。糖尿病大鼠内核层神经元线粒体膜去极化更为明显。线粒体 Ca2+摄取主要由线粒体钙单向转运体复合物介导胞质 Ca2+向线粒体基质内转运[35]，提示该复合物在钙离子稳态和离子通道稳态中起着重要作用。

4 线粒体动力学

线粒体是高度动态的细胞器，持续不断地进行分裂和融合，这一过程被称为线粒体动力学[36]。线粒体融合分为两步：线粒体融合蛋白1 (MFN1) 和MFN2调节线粒体外膜融合，视神经萎缩症蛋白1 (OPA1) 调节线粒体内膜融合[37]。Zhong等[26]研究发现，糖尿病大鼠和DR患者视网膜线粒体MFN2表达均显著降低。Duraisamy等[38]研究发现，视网膜内皮细胞过表达MFN2可防止高血糖诱导的线粒体结构和功能损伤，并改善 mtDNA 损伤及其转录，其机制可能与其调控线粒体稳态和抑制表观遗传修饰 (无DNA甲基化)有关。

OPA1在线粒体中既调节线粒体嵴结构，也能独立调节线粒体融合[13,39]。Kim等[40]研究首次证明，糖尿病动物视网膜中OPA1表达降低与糖尿病视网膜毛细血管细胞中线粒体碎片形成有关。随后的研究发现，糖尿病诱导OPA1下调，刺激 Bax 激活，触发细胞色素C释放并促进视网膜血管细胞凋亡，最终导致与 DR 相关的脱细胞毛细血管和周细胞鬼影的发展。OPA1表达水平降低，而且OPA1蛋白的加工在糖尿病患者视网膜中也可能受到损害[41]。研究表明，OPA1缺乏会产生异常活化的T细胞并促进炎症发生[42]，参与DR 炎症反应。可见未来的研究应着眼于DR发病中 OPA1 减少的机制，或许可以改善线粒体生物学损伤。

线粒体裂变受动力蛋白相关蛋白 1 (DRP1) 及其裂变蛋白 1 (FIS1)、线粒体裂变因子 (MFF)等调节[43]。研究表明，在高糖环境下，大鼠视网膜内皮细胞 Drp1 和 Fis1 表达上调，这将会促进线粒体分裂，增加Caspase-3、Bax 活性，线粒体呼吸受损，导致细胞凋亡[44]。后有研究表明，抑制 DRP1 可降低 DR小鼠视网膜血管细胞凋亡和随后的无细胞毛细血管发育等。DRP1 水平的增加与视网膜血管病变的发展密切相关，抑制其表达可以预防DR患者血管细胞凋亡[45]。

5 线粒体DNA修复

mtDNA 存在一个非编码区，即置换环 (D-loop)，具有必不可少的转录和复制元件，该区域在 DR的发展中极易受到氧化损伤[46]。线粒体具有多种途径来修复受损的 mtDNA，包括直接逆转、碱基切除修复 (BER)、单链断裂修复和错配修复 (MMR)[47]。尽管糖尿病患者视网膜中 BER 酶的 mRNA 水平增加，但这些酶无法到达线粒体。MMR系统，主要表现为视网膜中两种主要MMR蛋白 (Mlh1 和 Msh2)水平的降低。Msh2 主要与核 DNA 聚合酶 β 相关，Mlh1 与 mtDNA 聚合酶 γ (POLG) 相关。研究已经证明， mtDNA 复制的限速酶 POLG，在糖尿病患者的视网膜及其毛细血管细胞中低于正常水平且活性受到抑制，并且线粒体中 8-羟基-2’-脱氧鸟苷水平增加[48]。高血糖对DR具有长期持续的不利影响，即使血糖得到控制后，视网膜病变仍会在相当长的一段时间内继续进展，即存在代谢记忆现象[2,49]。研究证明，在糖尿病大鼠的视网膜中，纠正高血糖后线粒体功能持续失调，D 环区域受损且 POLG 异常，BER 系统和 mtDNA 转录仍然低于正常水平，可见糖尿病环境引起的视网膜 mtDNA 中的任何错配均没有得到正确纠正[48]。另有研究表明，表观遗传修饰会产生记忆现象，例如DNA甲基化[50]。视网膜mtDNA一旦被高血糖诱导DNA甲基化，即使恢复正常血糖也不会逆转，POLG的调节区仍然存在高甲基化状态。此外，由于线粒体持续的功能失调，碱基错配继续在线粒体 DNA 中积累，随后导致线粒体功能障碍。因此，Mishra等[21]研究认为，DNA甲基化或脱氨基的调节可能通过调节碱基错配和线粒体功能障碍来阻碍DR的进展。

6 线粒体生物发生

过氧化物酶体增殖物激活受体γ-辅激活因子1-α (PGC-1α) 是线粒体生物发生的主要调节因子，通过调节一系列核转录因子的活性，包括核呼吸因子1(NRF1)和NRF2[6]。研究表明，PGC-1α(-/-) 小鼠的视网膜血管周细胞覆盖率降低、血管丛结构破坏和低灌注，与野生型小鼠相比，暴露于高氧的PGC-1α(-/-) 小鼠视网膜血管发育异常，伴随着视网膜出血和高度非结构化的区域，其机制可能与其增加ROS 的产生和影响VEGF-A 信号通路改变有关[51]。

NRF1是一种关键的核编码转录因子，调控众多编码线粒体功能基因的表达，例如线粒体转录因子A(TFAM)和细胞色素氧化酶IV。在DR小鼠模型中，PGC-1ɑ、NRF1 和 TFAM 基因的转录增加，但 TFAM在线粒体中积累显著减少。在DR的视网膜内皮细胞中，高葡萄糖减少了线粒体的数量，并抑制其相关转录因子表达[52]。线粒体生物发生减少的机制可能与由 POLG 催化的 mtDNA 复制受损有关。POLG 酶是一种异源三聚体，由一个 140 kDa 催化亚基POLG1和一个 55 kDa 辅助亚基POLG2 组成，全酶与 mtDNA 解旋酶发挥作用。在DR中，POLG1、POLG2和解旋敏Twinkle(线粒体5’-3’ DNA 解旋酶)基因的转录减少，使其向线粒体的易位也减弱，从而抑制线粒体生物发生[17,46]。

7 线粒体自噬

线粒体的自噬清除被称为线粒体自噬，在去除受损线粒体方面发挥着重要作用[53]。Piano等[54]研究发现，DR患者血管病变之前视网膜神经元丢失的主要原因并非传统观点里的细胞凋亡而是自噬。Song等[55]研究发现，刺激AMP激活的蛋白激酶(AMPK)可以通过调节自噬和线粒体功能来延缓糖尿病诱导的光感受器变性。细胞应激反应状态下，AMPK通过磷酸化MFF发挥关键调控作用[56]。AMPK一旦被激活将直接磷酸化，并激活UNC-51类似自噬激活激酶1 (ULK1),进一步诱导自噬。AMPK还可以通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)促进自噬，解除对ULK1的抑制。此外，AMPK诱导胰腺β细胞中的Drp1磷酸化并减轻棕榈酸诱导的线粒体碎裂；激活AMPK在调控线粒体形态中发挥着重要作用[53]。白藜芦醇通过激活 AMPK/Sirt1/PGC-1α信号通路逆转高糖诱导的视网膜毛细血管内皮细胞凋亡，可能是被用于预防DR的方法之一[57]。

DR状态下， ROS 的产生在自噬激活中发挥着重要作用。视网膜神经节细胞 (RGC) 具有长轴突，线粒体密度相对较高，这使其对能量缺乏更加敏感，并且更容易受到氧化应激的影响。RGC死亡在DR的早期阶段发挥重要作用。研究证明，在眼压升高、视网膜缺血、视神经横断、轴突切开术或视神经挤压伤后，RGC中自噬被激活[58]。因此，促进线粒体自噬能够诱导受损线粒体降解，对线粒体质量控制调节起着关键作用，并为治疗DR 提供潜在治疗靶点和策略。

8 总结和展望

综上所述，糖尿病状态下线粒体受损，包括线粒体功能和结构受损、ETC活性受损和ROS形成增加，而线粒体功能障碍在 DR发展中起着核心调控作用。由于众多途径会导致线粒体损伤，而受损的线粒体反过来又会导致多种代谢异常。以线粒体为靶点，如抑制ROS的产生、抗氧化反应、改善线粒体损伤、调节线粒体的融合和裂变、mtDNA 修复和生物发生、线粒体自噬，有可能成为治疗 DR 的新靶点。因此，进一步深入研究线粒体功能紊乱在 DR 的发病机制中至关重要，可为临床治疗 DR提供新的靶点和治疗策略。