奶牛子宫炎的分类及诊断方法研究进展

孙琼飞，屈勇刚*，李彦芳*

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2.动物疾病防控兵团重点实验室，新疆石河子 832003)

奶牛在分娩后子宫腔容易受到细菌污染，病原菌经常持续存在，致使子宫疾病发生，这是导致母牛不孕的一个关键原因[1]。奶牛子宫炎是一种奶牛产后危害较大的子宫疾病，该病会破坏奶牛的繁殖性能并降低奶牛群的生产力和盈利能力。据统计，单以欧盟而言，每年仅因奶牛子宫炎造成的损失就高达1400万欧元，我国每年因该病损失数亿元[2]。因此，对该病的诊断和防治具有重要的经济意义[3]。

目前对子宫炎的分类没有金标准[4]。根据研究报道，诊断方法可分为现场诊断技术和实验室诊断技术两大类，主要包括临床诊断、超声诊断、Metricheck装置评估、AHMS、细胞学诊断、生物标志物、免疫细胞、病原学诊断等方法。如何做好该病的诊断，已成为国内外研究的热点之一。本文对该病的分类、不同类型的定义、诊断技术等方面进行概述，旨在能为该病快速诊断和早期防治提供参考。

1 奶牛子宫炎的分类

奶牛子宫炎指产后子宫内膜炎或子宫内膜及深层组织的感染，可影响奶牛繁殖功能，可出现或不出现全身症状[5]。以奶牛产后21 d为界限，将奶牛子宫炎分为子宫炎和子宫内膜炎，产后21 d内的子宫感染为子宫炎，产后21 d后则为子宫内膜炎。子宫炎又可分为产褥期子宫炎和临床型子宫炎，而子宫内膜炎又可分为临床型子宫内膜炎(clinical endometritis，CE)、亚临床型子宫内膜炎(subclinical endometritis，SE)[6-8]

1.1 产褥期子宫炎

产褥期子宫炎主要发生于产后早期，一般于产后10 d内开始发病。发病前期，子宫内部存在大量的红褐色、有恶臭气味的分泌物或者有白色或者黄色蛋白样的子宫分泌物排出；后期子宫壁水肿变厚，整个子宫壁可能会出现一种急性炎症渗出物，脓性分泌物的排出相比前期有所减弱。同时还可能伴随其他的症状，例如体温上升至39℃以上，奶牛的采食量明显下降，产奶量直线下降，精神沉郁、衰竭等[9]。

1.2 临床型子宫炎

在某些严重的细菌感染病例中，即使每天监测直肠温度，并未检测到奶牛发热，亦无全身症状，但在分娩后21 d内，子宫异常增大且阴道内可检测到脓性子宫分泌物的奶牛可归类为临床型子宫炎[5-7]。

1.3 临床型子宫内膜炎

Gobikrushanth M等[10]以产后21 d或者更长时间，临床诊断通常通过阴门外部观察，或者采用阴道镜检查法，来观察奶牛子宫大小、形状、子宫内分泌物、以及子宫内膜的厚度等指标是否异常来判定。临床型子宫内膜炎(CE)伴随着病原微生物的感染，奶牛的临床症状有不同的表现，一般根据阴道分泌物情况被分为4个等级：0级为黏液清亮或半透明；1级为黏液中有白色或灰色浓斑；2级为分泌物中白色或灰色黏脓性物质≤50%；3级为分泌物中白色或黄色脓性物>50%，有时呈血红色[11]。与SE相比，CE对子宫内膜组织损伤更大，更易造成不可逆的后果，或演变为SE，长期危害奶牛生殖系统。

1.4 亚临床子宫内膜炎

患亚临床子宫内膜(SE)的奶牛阴道内没有脓性物质，正常发情，但受胎率低下、屡配不孕，只能通过细胞学诊断[12]。一般通过测定子宫腔内中性粒细胞(PMN)的比例，来诊断SE。在分娩后20 d～33 d，若 PMN%大于18%或产后34 d～47 d，PMN%大于5%即可诊断为SE[13-14]。因SE没有明显的临床症状与健康奶牛不易分辨，在生产中往往容易被忽视，从而影响奶牛的繁殖性能。

2 奶牛子宫炎诊断技术

2.1 现场诊断

2.1.1 临床诊断法 临床上对奶牛子宫炎的诊断主要是通过外部观察法、直肠检查法和阴道检查法。各种子宫内感染临床表现都会因病情的轻重有所区别。但发病奶牛一般会出现精神不佳，食欲减退，外阴流有黏性分泌物等症状，以此综合奶牛的发情状况以及黏性分泌物的性质等症状，可得出初步诊断。直肠检查法在该病诊断中也发挥着巨大的作用，但此检测手段需要操作者拥有丰富的临床经验，且能熟练掌握不同时期奶牛子宫的形态。因此，该方法具有一定的局限性。阴道检查法是借助阴道内窥镜来对阴道内脓性物质的量进行评估，从而对子宫内膜炎进行诊断，可以通过观察子宫形态，里面是否有脓性分泌物来判断，但该方法不能用于SE的诊断。

2.1.2 超声诊断技术 随着国内外B超使用越来越普遍，越来越多的学者探究使用B超技术来诊断奶牛子宫炎。B超诊断主要是通过B超探头采集奶牛子宫内的声像图，观察子宫形状大小有无异常、子宫内分泌物的量，以及子宫体或子宫角边缘回声强度是否规则，来辅助诊断子宫内膜炎[15]。Kasimanickam R等[13]发现B超和细胞学方法联合使用可以明显提高SE的检出率。Sharma A等[16]运用多普勒超声发现轻度子宫内膜炎的脉搏、阻力指数和加速时间明显高于中度和重度子宫内膜炎，然而，与轻度子宫内膜炎相比，中度和重度子宫内膜炎的子宫中动脉血流速度、血流量和舒张末期血流速度明显升高。

2.1.3 Metricheck装置评估法(MT) 阴道分泌物是确定奶牛是否存在子宫内炎症反应的最明显指标。目前，已有学者开发出一种用于检测阴道分泌物的Metricheck装置(MT)，可作为传统阴道镜检查的替代品。McDougall S等[17]在奶牛授配前35 d用MT装置和阴道镜比较子宫炎的诊断效果，结果发现MT装置和阴道镜对子宫炎检出率分别为60%和42%，MT装置对子宫炎诊断的检测灵敏度高于阴道镜，但特异性比阴道镜低。因此，MT装置可以容易取到阴道内分泌物，可以通过MT评估更多奶牛是否感染CE[18]。Kusaka H等[19]通过B超、MT、细胞刷三种不同方法监测产后2周～7周的28头奶牛，结果表明在产后7周B超和MT联合使用，是一种实用监测奶牛子宫健康的方法,在现场临床诊断中，应逐步推广。

2.1.4 自动健康检测系统(AHMS) 监测反刍的时间和活动量是非侵入性传感器技术的最新发展，可以用来评估奶牛的整体健康状况，并有助于检测患有子宫炎的奶牛。Liboreiro D N[20]等研究发现，与健康奶牛相比，患有子宫炎的奶牛，产犊后反刍率和活跃度降低。Stangaferro M L等[21]对1121头奶牛调查，与临床诊断相比，自动健康检测系统(automated health monitoring system，AHMS)诊断准确率明显较高，但通过AHMS进行健康指数评分，诊断子宫炎奶牛灵敏度为55%，对子宫炎和其他相关疾病灵敏度为78%。AHMS诊断有利于现场诊断，节省人力，可以及早发现奶牛异常，进行早期治疗。

2.2 实验室诊断

2.2.1 细胞学诊断法 细胞学诊断技术是一种准确、客观、可靠的检查方式，能有效区分不同类型的子宫炎，从而减少了假阳性的出现[22]。细胞学诊断通过子宫冲洗、子宫刷、子宫内膜活检、组织切片检查等方法进行。通过计算子宫内膜中性粒细胞数与总细胞数之间的比例，得出产后不同时期中性粒细胞所占的阙值，用于诊断子宫内膜炎，该方法是一种有效诊断SE的方法[23]。Wang M L等[24]对27头产后30 d奶牛通过生理盐水无菌冲洗子宫，子宫冲洗液通过离心，染色镜检，计算PMN的比例。将产后30 d奶牛子宫冲洗液中PMN比例18%设定为SE的阈值。Pascottini O B等[14]对42头产后35 d奶牛通过细胞刷技术，无菌进入子宫，将子宫内膜细胞刷样本涂抹在无菌载玻片上，染色镜检，计算PMN的比例。将产后35 d奶牛子宫内膜PMN比例5%设定为奶牛子宫内膜炎的阈值。当阴道内无脓性分泌物，且子宫内膜PMN≤5%时判定为亚临床子宫内膜炎；当阴道内有脓性黏液或脓性分泌物，且子宫内膜PMN≤5%时判定为临床型子宫内膜炎；当2%<子宫内膜PMN≤5%时判定为健康奶牛。因国内外对于细胞学诊断法的诊断时间有所区别，最佳检测时间不能确定，给子宫内膜炎的诊断带来很大困难。

2.2.2 生物标志物诊断法 随着越来越多的学者对奶牛子宫炎进行深入研究，奶牛各项生理指标不断被发现。Beltman M E等[25]研究发现产后4周～5周内的奶牛当IGF-1浓度低于40 ng/mL时更容易出现子宫感染。Pascottini O B等[26]通过分析围产期奶牛血清中各项指标发现，患有SE奶牛在产犊前1周，血清中钙的含量低于健康奶牛；在产后14 d内，血清中结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)、非酯化脂肪酸、β-羟基丁酸、以及球蛋白的含量均高于健康奶牛，而胰岛素样生长因子低于健康奶牛；在产后35 d白蛋白含量低于健康奶牛。总体来说，患有SE的奶牛血清中与系统性炎症和能量代谢相关的指标更容易受到影响。Wang X等[27]研究发现外泌体表达的某些小RNA如mi R-218可以抑制IL-1β、IL-6、TNF-α，以及趋化因子MIP-1β和MIP-1α的活性，调节炎症反应。因此，mi R-218可能成为一项诊断奶牛子宫内膜炎的生物学指标。Dervishi E等[28]通过测定患子宫炎奶牛产前8周、4周和1周奶牛早期尿液代谢物特征，发现在分娩前8周30种代谢产物发生改变，分娩前4周34种代谢产物发生改变，诊断为子宫炎那周还有20种代谢产物发生改变，这种改变一直持续到诊断后4周和8周，因此，根据代谢产物变化，可把许多氨基酸、三羧酸循环代谢物和单糖的排泄以及半乳糖、亮氨酸、赖氨酸和泛酸的联合检测可作为子宫炎的预测生物标志物。Wang Y Y等[29]运用超高效液相色谱对健康和临床型子宫内膜炎奶牛子宫分泌物进行比较代谢组学分析发现，与正常子宫分泌物相比，临床子宫内膜炎中香豆酸、苯甲酸和雌马酚的表达均下调；而L-苯丙氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸、亚油酸、花生四烯酸等代谢物表达均上调。生物标志物的出现为我们早期预测和预防奶牛子宫炎提供了一种新的途径和思路。

2.2.3 免疫细胞测定法 奶牛产后对传染病的易感性增加，通常归因于与过渡期相关的免疫功能紊乱。单核细胞在控制细菌感染的初始免疫反应中起着至关重要的作用。Pomeroy B等[30]调查27头奶牛在预产前42 d、14 d和产后14 d与子宫炎和乳腺炎的关系时，在这3个时间段CD14+T细胞比例增加，奶牛患产后疾病的概率会大大增加，CD14+T细胞有可能会作为将来早期预测奶牛子宫炎的一个诊断性指标。

2.2.4 病原学诊断法

2.2.4.1 传统细菌培养 子宫炎采样必须做好无菌操作，样品采集后，分别通过血平板培养基、厌氧培养基、麦康凯培养基、高盐甘露醇培养基、伊红美蓝培养基、SS培养基培养24 h～48 h，进行子宫炎致病菌的分离和纯化培养，再通过生化鉴定、生化分型将致病菌鉴别出来。可根据实际需求筛选敏感药物，用于子宫炎的治疗。化脓隐秘杆菌是临床子宫内膜炎的重要致病菌，革兰氏阴性厌氧菌如坏死梭杆菌、产黑素普雷沃氏杆菌可能与化脓性隐秘杆菌协同作用，导致CE[31]。但细菌分离纯化的过程操作繁琐，需要花费大量时间，且培养出的微生物不到微生物总数的1%，存在一定的弊端[32]。

2.2.4.2 分子生物学诊断技术 聚合酶链式反应(PCR)是近年来发展速度最快的一门生物技术，因不需要依赖于细胞生长，只需要简单扩增，就能将目的基因片段放大百万倍。该技术主要包括普通PCR、多重PCR和荧光定量PCR等。Bicalho M L S等[33]研究表明，当奶牛在产后1 d～3 d大肠埃希氏菌fimH阳性时，感染坏死梭形杆菌菌几率较高，产后8 d～10 d患子宫炎几率也增加；此外当奶牛产后34 d～36 d坏死梭形杆菌iktA阳性时，感染化脓隐秘杆菌几率增加，奶牛感染CE几率也增加。王宁宁等[34]通过多重PCR技术对临床型子宫内膜炎进行检测，结果表明该方法对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、乳房链球菌敏感性良好。

2.2.4.3 高通量测序技术 高通量测序技术是一种高靶向性，一次性可以测得几十万到几百万个基因序列，在兽医方面已经广泛用于畜禽疾病诊断、致病机理研究、耐药性分析等[35]。Wang M L等[24]利用高通量测序技术对比了健康奶牛和患有子宫内膜炎奶牛的子宫内膜中的菌群分布，发现在CE梭杆菌丰度增加以及Trueperella和Peptoniphilus的独特存在，为后续子宫内膜炎疾病的诊断与治疗提供科学信息。Carvalho M R等[36]发现类杆菌、卟啉单胞菌和梭杆菌似乎在属水平上表现出协同作用，从而导致子宫炎症。在物种水平上，坏死梭杆菌被确认为主要与子宫炎相关因素之一。

3 展望

目前，国内奶牛行业蓬勃发展，奶牛子宫炎已经成为危害中国养牛业健康发展，影响乳制品产量的关键因素。奶牛子宫炎诊断方法和判定标准并不统一，不同国家地区奶牛子宫炎的发病率也存在较大差异。但随着越来越多的科研工作者对奶牛子宫炎的深入研究，奶牛子宫炎分类标准越来越清晰，研究者普遍以21 d为标准分为子宫炎和子宫内膜炎，子宫炎又可分为产褥期子宫炎和临床型子宫炎，而子宫内膜炎又可分为临床型子宫内膜炎、亚临床型子宫内膜炎。也涌现出了许多新的检测技术。临床诊断、超声技术、Metricheck 装置评估法、AHMS等能在现场快速诊断奶牛子宫炎，这些方法敏感性高，适用于基层专业人员使用，特别是AHMS通过检监测奶牛反刍活动和活动量来判断奶牛是否感染子宫炎，极大节省人力。传统细菌分离培养法灵活度高，可重复操作，是使用最广范的一种技术。细胞学、生物标志物、免疫细胞、病原学诊断等需要严格依赖实验室才能做出诊断。但这些法准确率高、敏感性强，成本高，对操作人员具有严格要求，不适用于基层诊断。

综上所述，只有明确不同类型奶牛子宫炎的“金标准”，特别是SE诊断标准，才能做到对不同类型奶牛子宫炎的准确诊断。目前奶牛子宫炎快速诊断方法仍在研究阶段，随着越来越多的科研人员投入研究，相信在不久的将来，一定会研发出一种简单快捷、准确率高、敏感性强、成本低、特异性强的诊断方法。