小激活RNA在胃肠道肿瘤研究中的应用

王森泰，昝新全，万岱维，支巧明

（苏州大学附属第一医院普外科，江苏 苏州 215006）

小激活RNA（small activating RNA, saRNA）是21世纪新近发现的，与小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）具有相似结构，却能靶向诱导基因表达的短核苷酸双链RNA。与已广泛应用于细胞体外试验及动物试验研究的siRNA相比，saRNA在细胞内更稳定，saRNA诱导的基因激活（RNA activation, RNAa）作用也更持久。抑癌基因的失活被证明与多种癌症的发生发展有关[1]，而引人注目的是，自saRNA被发现以来，许多相关研究已经证明，saRNA能在多种恶性肿瘤中靶向激活抑癌基因的抗肿瘤功效，这说明未来saRNA有希望成为一种具有相当价值的靶向抗肿瘤药物。胃肠道是与外界直接接触的器官，是暴露于病原体的主要部位之一，细菌、病毒等病原体对胃肠道黏膜造成的反复损伤，可能诱发胃肠道组织细胞癌基因或抑癌基因突变，进而发展为癌症。由于早期无明显特异性症状，诊断率低，病程进展快，许多胃肠道肿瘤被发现时已经失去最佳手术治疗时机，甚至已经发生全身广泛转移，如何在这些病人的治疗中选择合适的药物及疗法，延长生存时间和提高生存质量，是胃肠科医生面临的重要挑战。在本综述中，我们重点介绍saRNA介导的RNA激活在胃肠道肿瘤研究中的应用进展，旨在为探索胃肠道肿瘤的新治疗方式提供新思路。

1 saRNA概述

1.1 saRNA的发现 早在20世纪60年代，Britten等[2]就提出了激活RNA（activator RNA）的概念，他们认为存在一类只分布于细胞核的RNA，这类RNA能与受体基因（receptor gene）结合形成序列特异性复合物并诱导生产基因（producer gene）转录相关RNA。这一想法与50余年后提出的saRNA激活模型[3]高度契合，然而在当时因为太过超前而没有引起重视。直到2006年，Li等[4]在E-cadherin，p21和VEGF等多个基因的距离转录起始点-200～-700 bp的启动子区域设计短双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA），意外地发现这些dsRNA上调了相应靶基因的表达，他们将这种具有靶向激活靶基因的短核苷酸双链命名为saRNA。几乎在同一时间，Bethany等[5]也报道了一类能上调乳腺癌细胞PR基因表达的小分子RNA，他们将其命名为agRNA，同Li等合成的saRNA一样，他们设计的RNA结构上也是由两条长度为21 个碱基，且3'端为2个悬垂的脱氧胸苷的RNA单链互补配对而成。与Li等有所区别的是，这些agRNA的靶序列位于起始位点上或附近。有趣的是，靶向PR基因-11/+8的agRNA在MCF7乳腺癌细胞系中诱导PR基因的表达，在另一种乳腺癌细胞系T47D中PR基因却被抑制。他们通过染色质免疫共沉淀试验还发现，PR基因的活化伴随着组蛋白H3K9和H3K14的乙酰化减少以及组蛋白H3K4处的二甲基化和三甲基化增加，这说明agRNA可能是通过改变染色体结构来激活基因表达。

1.2 saRNA作用的原理 saRNA是一类非编码RNA，具有与siRNA相同的结构，但是它们的生物学功能却完全相反。siRNA可以分别与AGO1、AGO2、AGO3和AGO4四种蛋白结合以获得活性，与siRNA不同的是，saRNA只能被特异性地加载到AGO2蛋白上，敲低AGO1，AGO3和AGO4都不会影响saRNA介导的基因激活，而单独沉默AGO2则消除了saRNA的基因调节作用[6]。目前，比较受认可的RNAa基因调控模型是Li等[7]提出的启动子靶向的saRNA诱导模型。在该模型中，外源性引入的saRNA被加载到细胞质中的AGO2蛋白上。AGO2蛋白通过切割和丢弃其中一条RNA链，形成一个活性的AGO2-RNA复合体，这一复合物通过主动转运或被动扩散进入细胞核。如果入核RNA单链的互补靶标存在于基因组DNA序列中或仍与DNA相连的反义转录本序列中，则AGO2-RNA复合物将结合到该区域，并进一步招募RNA转录相关酶RHA和CTR9，形成RNA诱导的转录激活（RITA）复合物[3]。CTR9是PAF1C的一个亚基，PAF1C可通过招募组蛋白修饰酶到RNA聚合酶Ⅱ（RNAP Ⅱ）上引起组蛋白修饰变化，调控转录的起始和延伸[8]，而RHA是一种DNA/RNA解旋酶，它可通过招募染色质重塑因子和转录激活相关因子来促进转录[9-10]，同时它具有招募RNAP Ⅱ的作用[11]。RITA复合物与hnRNPs、RNAP Ⅱ和各种转录因子结合，诱导靶基因表达[3,12]。尽管研究者们为完善RNAa机制模型做了不懈的努力，但为了更好更有效地将saRNA运用到临床疾病治疗中，更多的RNAa激活机制的细节仍需要阐明。

1.3 saRNA序列的设计 尽管saRNA已经被发现十余年，但该技术在生物学研究中的应用远不如siRNA广泛，一方面是由于对其机制的了解不足，另一方面是学界对其设计原则尚未统一。不同于siRNA具备完善的商业化订购系统甚至是多个操作简单快捷的序列设计网站可供选择，目前仍未有网站支持在线设计序列，研究者只能借鉴前人的经验不断地在靶基因启动子区碰运气。Li等[13]提出了12条原则：(1)目标序列从靶基因的正义链序列上筛选；(2)与基因正义链互补的RNA单链命名为引导链，靶基因正义链的3'端对应于RNA引导链的5'端；(3)saRNA靶点选择在正义链转录起始位点上游-1 200～-200 bp的区域；(4)每个靶点长度为19 个碱基。由此产生的saRNA双链在每条链的3'端具有悬垂的dTdT或UU；(5)靶点碱基的GC含量在40%～65%范围内；(6)不能够出现连续4个以上相同的核苷酸；(7)靶点的5'端热力学稳定性高于3'端；(8)第19个碱基是A；(9)第18个碱基是A或T，最好是A；(10)第七个碱基最好是T；(11)第20-23个碱基（靶点的3'侧翼，和saRNA的序列无关）最好是A或T；(12)选择目标序列时避开易受DNA甲基化影响的位点，如CpG岛、CpG位点和GC富集区。这些条件里，有些必须满足，如第12条，有足够证据证明DNA甲基化会影响RNAa活性[4]，有些则为非必须条件，在一个基因的启动子区里，能同时符合12个条件的靶点很难找到，Li等通过统计加权得分，对符合较多条件的序列进行进一步的生物学筛选以获得合适saRNA，筛选时经常会出现4、5条序列仅有1条有活性的情况。作为最早发现saRNA的科研团队，Li等所提出的规则看上去简单而易于执行，又较完善而具有一定说服力，后来的研究者多遵循这些规则去筛选得到他们所需要的saRNA，但也有人尝试其他的办法。Voutila等[14]希望设计出能有效结合并降解反义转录本的saRNA，为了识别潜在反义转录本，他们通过生物信息学方法寻找剪接表达序列标签（EST），在EST区域以及另一个经常产生反义转录本的区域：转录起始位点周围（+/-500 bp），运用筛选siRNA的方法去选择分数较高的序列。Voutila等同时也给出了筛选反义转录本层次过滤方法以及saRNA筛选的具体程序，他们的方法较之Li的方法更复杂，具有一定的操作门槛，而且从有效激活比例和基因激活效率上来看，也并没有比前者更好。同siRNA一样，saRNA可能引发脱靶效应，即以序列特异性或非序列特异性的方式诱发非预期的基因活性。为了避免序列特异性脱靶反应，所设计的序列还应该进行序列BLAST以避免与人类基因组其他核苷酸序列有显著同源性。另外，saRNA结构的修饰被证明可以阻断脱靶效应[15]。

2 saRNA在胃肠道肿瘤研究中的应用进展

2.1 胃癌 胃癌是全球发病率第五位的恶性肿瘤[16]，同时也是导致癌症相关死亡的第四大原因[17]。许多患者被诊断胃癌时已处于晚期，往往失去了手术根治的机会，同时又缺乏其他有效的治疗手段。随着靶向治疗时代的到来，基因靶向治疗胃癌成了近年研究的一大热点。

肿瘤高甲基化基因1（HIC1）是一种肿瘤抑制基因，编码一种转录抑制因子[18]。HIC1在多种上皮来源恶性肿瘤中因为启动子高甲基化而表达下调，Rood等[19]认为HIC1的表观遗传沉默是这些恶性肿瘤中的关键事件。Pan等[20]在胃癌组织芯片分析中发现胃癌组织中HIC1的表达较正常胃黏膜组织更低，HIC1下调同样也出现在胃癌细胞系中。他们在SGC-7901和NCI-N87两种胃癌细胞系中转染saRNA dsHIC1-2998，发现saRNA介导的HIC1表达上调可抑制胃癌细胞的增殖，诱导细胞周期阻滞及凋亡。这表明，HIC1是胃癌基因治疗的一个潜在靶点，而saRNA可以作为胃癌中激活抑癌基因表达的治疗选择。另外，他们筛选出来的具有活性的saRNA所作用的位置距转录起始点将近3 000 bp，这超出了Li等报道的-1 200～-200 bp范围，说明了RNAa的确切分子机制还需进行更深入的研究，目前saRNA设计的原则还有待进一步完善。

VEZT被认为是一种胃癌的抑癌基因，其表达与胃癌的预后相关[21]，VEZT编码一种质膜蛋白，与E钙粘蛋白复合物相互作用，在粘附连接中发挥重要作用[22]。Xie等[23]筛选得到一条可特异性上调VEZT的saRNA，体外试验结果证明了这种saRNA抑制了胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。为了排除saRNA的脱靶效应，Xie等同时转染能下调VEZT的shRNA，共转染的saRNA丧失了对胃癌细胞的抑制能力，证明该saRNA是通过上调VEZT来发挥抑癌功效。

脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1（PELP1）是雌激素受体α的协同激活因子，已被证实与多种癌症，尤其是激素依赖性癌症的致癌过程直接相关[24-25]。一些研究人员还确定了PELP1在激素无反应的肿瘤中的致癌功能，Yan等[26]发现PELP1在胃癌细胞系和临床胃癌组织中表达升高，他们使用了saRNA尝试上调胃黏膜正常上皮细胞系GES-1并且取得成功，saRNA增强了细胞的增殖能力。

2.2 结直肠癌 结直肠癌是我国癌症发病和死亡的主要原因之一。近年来，随着物质生活水平的逐渐提升和我国居民饮食结构的变化，结直肠癌的发病率呈上升趋势，发病年龄越来越年轻[16,27]。尽管近年来对结直肠癌的治疗已取得显著进步，在一些国家五年总生存率可达65%[28]，晚期结直肠癌患者的预后仍很差，因此，开发新型有效的疗法是未来结直肠癌研究的主要方向。

p21基因位于染色体6p21.2上，编码一种多功能CDK激酶抑制剂，这是一种p53的下游蛋白，可以通过p53依赖途径和非依赖途径调节细胞周期[29-31]。p21被证明是一种抑癌基因，在肝癌和结直肠癌等恶性肿瘤中，p21表达的上调被证明与抑制肿瘤细胞增殖有关[32-34]，因此，采用新技术方法上调p21对治疗多种恶性肿瘤有重要意义。p21-saRNA-322是Li[4]等发现的一种能有效上调p21的saNRA，已被证明能有效抑制膀胱癌[35]、前列腺癌[36]、肺癌[37]、肝癌[34]等多种癌细胞的增殖。Wang等[38]研究发现，在人结直肠癌细胞系HCT116、HCT116(p53-/-)和HT29中转染p21-saRNA-322后，p21的mRNA和蛋白表达水平明显上调，同时癌细胞的增殖受到抑制、凋亡率增加、细胞周期停滞在G0/G1期。进一步的体内试验也证实了p21-saRNA-322抑制结直肠癌细胞增殖的能力。同一研究团队的Feng等[39]进一步在体内应用p21-saRNA-322，考虑到静脉注射以及其他给药方式对核酸药物的过程损耗，他们开发了一种含p21-saRNA-322的三元脂质体复合物。这种药物通过阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）一方面凝聚saRNA，保护其不被降解，另一方面可促使被摄入细胞内的saRNA脱离溶酶体。药物的另一种成分透明质酸可被结直肠癌细胞膜表面过表达的CD44识别从而提高肿瘤细胞的摄取率，同时降低PEI的细胞毒性。该药物在CD44表达丰富的Lovo细胞中转染效率较仅含核酸与PEI的二元复合物高。体外实验表明，它能有效激活p21 mRNA和蛋白的表达，阻断细胞G0/G1期的细胞周期，抑制癌细胞增殖和集落形成。体内分布实验表明，它能优先在直肠壁积累，有效积累长达10 h。进一步的小鼠体内试验[40]将HT29细胞注射到小鼠结肠黏膜下，荧光结果显示药物成功递送到肿瘤部位，并且，这种通过直肠给药的核酸药物显著刺激了肿瘤组织中p21的表达，并抑制原位结直肠肿瘤的生长。

肺腺癌转移相关转录物1（MALAT1）基因转录一种长8.1的非编码RNA（lncRNA），这种lncRNA可以调节丝氨酸/精氨酸剪接因子的活性，与多种恶性肿瘤增殖能力的增强有关[41-43]。由于MALAT1基因长度较长，传统的表达克隆载体很难高效地转染到细胞中。Yang等[44]首次以RNAa技术上调MALAT1表达，并证明了过表达MALAT1显著促进结直肠癌细胞体外增殖、侵袭和迁移，以及体内肿瘤生长和转移。这表明，作为一种新型的基因调控技术，在激活一些较大基因时，saRNA比传统技术更具有优越性。在另一项结肠癌抑癌基因VMP1的相关研究中，Wang等[45]分别用saRNA和VMP1的激活因子GLI3处理HCT116细胞系，发现无论是对癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响，还是提高细胞对5-FU药物的敏感性，saRNA都不逊色于GLI3。

目前，最成功的saRNA相关药物是MTLCEBPA，这是一种用于治疗肝脏肿瘤的药物，目前已进入1期临床试验[46]。转录因子CEBPA是一种调节肝脏稳态的蛋白，CEBPA表达下调与多种致癌过程有关，包括细胞周期控制，增殖和血管生成等。Huang等[47]将小鼠结肠癌细胞系CT26注射到对抗PD-1治疗敏感的小鼠中用以构建小鼠结直肠癌模型，然后注射MTL-CEBPA和PD-1抑制剂。MTLCEBPA或PD-1抑制剂单独处理的动物肿瘤体积差异并无统计学意义，而同时注射PD-1抑制剂和MTLCEBPA组的肿瘤体积明显小于对照组，说明MTLCEBPA和PD-1抑制剂具有协同作用。这种关系在进一步的PCR试验得到证实：同时注射PD-1抑制剂和MTL-CEBPA的肿瘤组织CEBPA mRNA表达量更高（8.69倍，P＜0.0001）。在联合治疗组还检测到免疫基因激活、MDSC抑制基因（IRF4和IRF8）表达增加、MDSC促进基因（COX2）表达减少和血管生成基因减少，说明PD-1抑制剂和MTL-CEBPA协同治疗更好地激活了免疫细胞的活性。

Krüppel样因子4（KLF4）是一种进化上保守的含锌指结构转录因子[48]，调节细胞生长、增殖和分化等多种生物学过程[49]。Zhou等[50]将两条已经在前列腺癌中证实有上调KLF4活性的saRNA转染到多种结直肠癌细胞系中，发现只有其中一种saRNA发挥了作用，且仅有Caco-2、HCT116和NCM460三种细胞系对该saRNA敏感，这表明了对于不同的细胞系，saRNA具有序列特异性以及细胞特异性，这可能是因为不同细胞系的基因启动子区表观遗传指纹不同。可以推论的是，未来saRNA作为靶向药物应用于临床，患者个体间的药物敏感性可能也大相径庭，单从另一方面考虑，不同的个体可能对不同序列的saRNA分子敏感，在基因测序更精准以及人类对基因组解读更精确的大前提下，saRNA有望实现肿瘤个体化精准治疗。

3 展望

自saRNA被发现以来，将这种基因调控技术运用到临床的尝试就没有中断过，在癌症这类涉及多种抑癌基因下调的复杂疾病治疗方面更是显示出巨大的希望。相比已被应用到临床的一些肿瘤辅助治疗方法，RNAa是目前少有的能够有效恢复抑癌基因表达的疗法，作用长效的同时又不改变基因组。目前第一种saRNA药物MTL-CEBPA的临床试验已经在国外启动，MTL-CEBPA在肝癌患者的疗效已初步获得肯定，笔者认为，在新的saRNA还未问世之前，还可以尝试在其他涉及CEBPA下调的恶性肿瘤研究里开展MTL-CEBPA的应用研究。在未来，随着人类对RNAa生物学本质的理解不断加深和核酸递送技术的进步，我们期待更多治疗性saRNA被发现并应用于人类疾病的治疗中，为患者提供更精确的治疗。