基于网络药理学和分子对接技术研究β-细辛醚治疗胶质母细胞瘤的作用机制

黄冠又 侯小红 张 欣 甘鸿川

(贵州医科大学 附属金阳医院[贵阳市第二人民医院] 神经外科， 贵州 贵阳 550081)

多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是胶质瘤最主要的病理类型，为Ⅳ级高级别胶质瘤，约占48.6%[1]。目前GBM标准治疗方案主要包括安全有效的最大范围手术切除后同步放化疗和替莫唑胺辅助化疗[2]。由于肿瘤抗原异质性，化疗存在血脑屏障、耐药性和放疗抵抗等因素，GBM的治疗仍面临巨大挑战[3]。因此，深入了解胶质瘤发生、发展的特点和分子机制，发现新的分子标记物，寻找安全、毒性小的治疗药物对于治疗GBM具有重要意义。

中药石菖蒲具有化湿开胃、开窍醒神功效，对神经系统具有兴奋、抑制双重调节作用，具有抗肿瘤、增强记忆力、益智等多种显著药理作用[4]。β-细辛醚(β-asarone)是石菖蒲的主要有效成分，研究报道β-asarone在胶质瘤[5]、肺癌[6]、胃癌[7]等恶性肿瘤中具有抑制细胞增殖的作用，并且对神经系统退行性疾病、抑郁症、脑梗死、癫痫等都有一定的治疗效果[4]。本研究拟采用网络药理学和分子对接方法预测β-asarone的作用靶点和机制，以期为β-asarone治疗GBM提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 药物-疾病共同靶点筛选

在Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/)检索β-细辛醚(β-asarone)的结构，导入PharmMapper数据库(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)，以Norm Fit>0进行靶点筛选，将β-asarone结构输入SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)预测靶点。在OMIM(https://omim.org/)、Disgenet(https://www.disgenet. org/)、Genecards(https://www.genecards.org/)等数据库中，选择物种为“Homo sapiens”，在数据库中输入疾病名称“glioblastoma”，查找并下载与GBM相关的基因和靶点。根据检索到的相关药物-疾病靶点使用Venny 2.1在线作图工具筛选GBM潜在作用靶点。

1.2 蛋白互作网络、成分-作用靶点-疾病网络的构建

将β-asarone与GBM作用靶点输入STRING(https://string-db.org/)数据库进行蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)分析，输入Cytoscape 3.8.2软件对网络进行分析，筛选自由度(degree)值较高(值越大表明其生物功能越多)的关键基因，以排名前20的基因作为β-asarone治疗GBM的关键基因。

1.3 靶点功能通路富集分析

使用Bioconductor生物信息软件包(http://www.bioconductor.org/)以P<0.05为条件进行关键靶基因的基因本体生物过程富集[8]和(kyto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路功能富集分析[9]，得到β-asarone发挥抗肿瘤作用参与的GO功能和信号通路。

1.4 成分-靶点分子对接

从PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载核心靶点蛋白质3D结构，应用Pymol 2.3.4软件插件找到对接活性位点，去除水分子和原配体。在PubChem数据库搜索β-asarone的3D结构信息，然后导入PubChem最小能量化，利用OpenBabel 3.0软件转化为pdb格式。最后将得到的蛋白结构(受体)及β-asarone结构运用Autodock 1.1.2软件进行分子对接，用Pymol 2.3.4软件将对接结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 β-asarone作用靶点筛选结果

在PubChem数据库和SwissTargetPrediction数据库进行β-asarone成分的作用靶点预测和筛选，共获得294个靶点。基于OMIM、Disgenet、Genecards数据库检索，共获得疾病靶点759个。通过Venny 2.1在线软件作图工具绘制韦恩图，筛选后获得药物-疾病共同靶点38个(见图1)。

图1 β-细辛醚与胶质母细胞瘤共同靶点韦恩图

2.2 疾病-靶点-成分网络构建

在Cytoscape 3.8.2软件中，绘制出“疾病-靶点-成分”相互作用的网络图(见图2A)。图中紫色代表β-asarone，蓝色代表38个共同靶点，红色代表疾病(胶质母细胞瘤)。

2.3 PPI网络构建及分析

将上述38个靶点输入到STRING数据库，构建靶蛋白相互作用网络，将靶点相互作用的网络导入Cytoscape 3.8.2软件，绘制PPI网络图(见图2B)。其中节点表示蛋白，degree表示连接到节点的线条数，线条越多表示蛋白与蛋白间的关联度越大，红色节点degree表示其关联度较大(生物功能较多)。由图可示，HRAS、CASP3、AKT1、SRC、CCND1、HSP90AA1、EGFR、MAP2K1、CDK2、CDK4、STAT1等靶点的degree值较高，在PPI网络中起着重要的联系作用。

2.4 核心靶点筛选

将PPI网络导入Cytoscape 3.8.2中，对网络进行拓扑分析，平均degree值为18，以degree>18为条件筛选核心靶点，靶点degree值较高，表明其可能在β-asarone治疗GBM中发挥重要作用。degree值排名最高的前几位靶点有AKT1、CASP3、HRAS、SRC等(见图2C)。

注： A：疾病-靶点-成分相互作用的网络图； B：蛋白互作网络图； C：基于PPI拓扑分析的核心靶点排序图2 β-细辛醚治疗GBM的潜在靶点

2.5 富集分析

对38个共有靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析。以P<0.05筛选GO生物过程的前20条通路进行展示，如图3所示。结果显示，发现共有靶点可能调控了蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性的正性调节、肽基丝氨酸修饰、细胞对化学压力的反应、氧化应激反应、上皮细胞增殖调节等生物过程。KEGG信号通路分析中，选取P值较小的前20条通路(见图4)，主要涉及PI3K/Akt、癌症中的蛋白聚糖、Rap1、FoxO等信号通路。

图3 β-细辛醚治疗GBM共有靶点GO生物过程分析

图4 β-细辛醚治疗GBM共有靶点KEGG通路分析

2.6 分子对接

对筛选出的核心靶点和基因(CDK2、MAP2K1、AKT1、CASP3、HRAS)进行分子对接。结果显示β-asarone与PPI五个核心靶蛋白结合能绝对值均大于4.25 kcal/mol，表示β-asarone和核心蛋白形成的构象能量低，结构稳定，结合活性较高。其分子对接模式见图5。

注：A：CDK2； B：MAP2K1； C：AKT1； D：CASP3； E：HRAS； HIS-295：组氨酸-295； LYS-97：赖氨酸-97； VAL-211：缬氨酸-211； LEU-347：亮氨酸-347； MET-39：蛋氨酸-39； ARG-68：精氨酸-68； GLN-99：谷氨酰胺-99图5 β-细辛醚与核心蛋白分子对接模式

3 讨论

研究发现，β-asarone能促进替莫唑胺(temozolomide，TMZ)进入细胞膜，抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，间接促进TMZ对胶质瘤的作用效力，但β-asarone对GBM的作用机制尚不清楚。本研究通过网络药理学方法和分子对接技术分析了β-asarone治疗GBM的分子机制，发现AKT1、CASP3、HRAS、CDK2、MAP2K1等靶点在治疗GBM中可能起重要作用。

AKT1的degree值在所有靶点中最高，是丝/苏氨酸蛋白激酶，能调节细胞增殖和生长，对细胞凋亡和细胞周期的调控起重要作用[10]。AKT抑制剂可拮抗GBM干细胞样细胞的生长[11]。特异性靶向抑制AKT1结合标准治疗方案可能是提高GBM患者生存率的治疗策略。

CASP3是细胞凋亡的关键执行者，在肿瘤发生发展中起重要作用。在肿瘤细胞中，β-asarone可促进CASP3的激活。如Wu等[12]研究发现β-asarone可以通过激活CASP3、CASP8、CASP9等抑制胃癌细胞的增殖。Li等[5]研究发现β-asarone通过调控hnRNP A2/B1相关信号通路，增强CASP3的表达，从而诱导胶质瘤细胞凋亡，抑制上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，最终阻断胶质瘤U251细胞的迁移和侵袭。

HRAS基因是与人类肿瘤相关的RAS基因家族，定位于11号染色体，RAS基因在胶质瘤中可表现为突变和高表达，其中HRAS的高表达与胶质瘤发生密切相关，并与胶质瘤恶性程度呈正相关[13]。

CDK2为丝氨酸/苏氨酸激酶，属于CDKs家族。CDK2能促进胶质瘤侵袭和化疗抵抗，上调的CDK2能维持胶质瘤细胞的放疗抵抗；相比低级别胶质瘤，CDK2在高级别胶质瘤中表达水平显著增高，并且较高的CDK2表达水平和预后不良相关[14]。体外实验表明，CDK2抑制剂可以降低化疗药替莫唑胺耐药性，并诱导GBM细胞凋亡，提示CDK2抑制剂联合化疗药物对GBM的治疗具有重要意义[15]。

MAP2K1(又称MEK1)是一种双特异性蛋白激酶，能磷酸化ERK中的苏氨酸和酪氨酸残基。一项关于MAP2K1的泛癌研究表明，与正常组织相比，MAP2K1在多种癌症中过度表达，生存分析显示其高表达患者生存期较低表达显著降低[16]。研究表明，MEK抑制剂通过抑制MAPK/ERK通路降低GBM原代细胞的生长速度，动物模型中可抑制GBM肿瘤生长，并能延缓GBM复发[17]。

进一步对β-asarone和GBM共同靶点进行信号通路富集分析，发现共同靶点可能与调控肿瘤细胞生长、转移和增殖有关，包括蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性的正性调节、氧化应激反应、上皮细胞增殖调节、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶复合物、泛素样蛋白连接酶结合等。信号通路上，主要与PI3K/Akt信号通路、癌症中的蛋白聚糖、Rap1信号通路、miRNAs等相关。

PI3K/Akt/mTOR信号通路通过调节细胞周期活动促进肿瘤的生长与进展，与GBM细胞增殖、分化、发展和血管生成密切相关，IDH野生型GBM在该通路中可见突变[18]。研究表明，部分miRNAs表达可调节胶质瘤中PI3K/Akt通路，如miR-579、miR-548和miR-4698通过影响这一途径抑制GBM的增殖和侵袭，该通路可能成为改善GBM患者生存预后的一个有前景的靶点[19]。研究发现，β-asarone可通过上调PI3K/Akt磷酸化水平促进NRF2和HO-1表达，并通过该通路抑制氧化应激[20]。还有研究表明，β-asarone对胃癌细胞裸鼠移植瘤有一定增殖抑制作用，可能与β-asarone通过抑制PI3K/Akt通路抑制胃癌EMT有关[21]。上述研究表明β-asarone可靶向调控PI3K/Akt通路，抑制肿瘤的生长。

综上所述，本研究发现AKT1、CASP3、HRAS、CDK2和MAP2K1等可能是胶质母细胞瘤的核心治疗靶点，PI3K/Akt、Rap1、miRNAs等可能是其主要作用通路。本研究存在一定局限性，只对石菖蒲的主要成分β-asarone进行数据挖掘分析。今后为更好地应用中草药治疗GBM，需要进一步深入研究石菖蒲更多有效成分，对药物作用靶点以及药物通过哪条信号通路发挥药效进行更深入研究，同时需要后期基础和临床研究进一步证实。