骨髓间充质干细胞成软骨分化机制研究进展

谢犇 秦庆庆 杨杜斌 王一坤 阳庆林 王勇平

1兰州大学第一临床医学院（兰州 730000）

2兰州大学第一医院骨科（兰州 730000）

骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一种未充分分化的类中胚层细胞，在特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞、神经元等，由于其具有取材方便、对机体损伤小、免疫原性小等优点，已作为组织工程学中重要的种子细胞被广泛应用于科研与临床[1]。软骨组织属于结缔组织，其内缺乏血管、神经和淋巴系统，由细胞外基质与分散其间的软骨细胞共同构成。随着人口老龄化的发展，软骨病变和骨关节炎发病率的升高，极大程度上增加了临床和社会经济负担。然而，关节软骨损伤自我修复力却非常有限，并且BMSCs成软骨细胞分化过程易发生肥大变性进而导致纤维软骨的生成，这使得软骨相关疾病的治疗成了世界性难题[2]。使用BMSCs并诱导其向软骨细胞分化是组织工程学的一种新的治疗方法并被逐步应用于临床[3]。物理、药物、蛋白质、细胞因子、RNA、基因等多种影响因素可通过不同的信号通路影响BMSCs成软骨分化。本文采用“骨髓间充质干细胞”、“软骨细胞”、“软骨分化”、“信号通路”作为中文检索词，“bone marrow mesenchymal stem cell”、“cartilage”、“Cartilage differentiation”、“Sig-naling pathway”作为英文检索词，检索中国知网、万方数据、维普、Pubmed、Web Of Science数据库2011年至今的文献，总结分析BMSCs成软骨分化过程涉及的信号通路及相关调控因素，为相关科研与临床提供参考。

1 Wnt/β-catenin信号通路

Wnt/β-catenin信号通路是Wnt信号转导通路的一种，Wnt是一种分泌型糖蛋白，可与细胞表面特异性受体相互作用，通过一系列过程引起β-catenin的累积，β-catenin是一种多功能的蛋白质，游离的β-catenin可进入细胞核进一步调控相应基因的表达[4]。药物、蛋白质、细胞因子、RNA等因素可通过影响Wnt/β-catenin信号通路调控BMSCs成软骨分化。Yu等[5]发现使用雷奈酸锶（SrR）诱导后大鼠BMSCs有较强的软骨生成能力，并且SrR可逆转β-catenin激动剂氯化锂（LiCl）所引起的抑制软骨生成作用，这说明SrR可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路进而促进BMSCs向软骨分化。汪建样等[6]通过对照实验发现淫羊藿素（icaritin，ICT）可促进BMSCs中蛋白多糖（aggrecan）、Ⅱ型胶原（Colla-gen，COL-Ⅱ）、β-catenin及前体mRNA的表达，这表明ICT可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠BMSCs体外成软骨分化。Rojas等[7]发现Wnt/β-catenin信号通路抑制剂Dickkopf相关蛋白1（dickkopf-related protein 1，DKK1）可通过阻断Wnt/β-catenin通路刺激关节软骨标志物COL2A1和糖胺聚糖（glycosaminogly-can，GAG）的表达进而促进BMSCs成软骨分化。Deshmukh等[8]的实验发现新型小分子物质SM04690可通过抑制Wnt/β-catenin通路促进大鼠骨关节炎（osteo-arthritis，OA）模型软骨生成，抑制关节破坏。Fu等[9]使用不同浓度的骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-7作用于兔BMSCs，结果显示BMP-7可刺激糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase，GSK）-3β磷酸化，增加β-catenin、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和Runt相关转录因子2（runt-relat-ed transcription factor 2，Runx2）的表达，并且这种作用可被β-catenin信号通路抑制剂XAV-939抵消。以上结果表明BMP-7可能通过Wnt/β-catenin通路诱导兔BMSCs成软骨分化。Lu等[10]分别在常氧和低氧条件下，添加转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β3诱导大鼠BMSCs，发现低氧条件下BMSCs高表达COL-Ⅱ、aggrecan及其前体mRNA，并且β-catenin表达量下降，这表明在低氧环境下TGF-β3促进BMSCs成软骨分化的能力可能与抑制Wnt/β-catenin通路有关。Melnik等[11]通过比较人关节软骨细胞及肥大软骨细胞中miRNA的表达谱，发现miR-218在人BMSCs成软骨分化过程中靶向促进肥大标志物MEF2C、X型胶原蛋白α1链（COL10A1）和Runx2的表达来达到抗肥厚作用，并且这种作用可被Wnt/β-catenin信号通路的激活而抵消，这表明miR-218可能通过抑制Wnt/βcatenin信号通路进而促进人BMSCs成软骨分化。Li等[12]的研究发现外泌体来源miR-8485沉默损害了外泌体诱导的促BMSCs成软骨分化作用，且miR-8485可激活Wnt/β-catenin通路，这说明miR-8485可能通过Wnt/β-catenin通路调控BMSCs软骨分化。Huang等[13]发现转染miR-26b小干扰RNA（siRNA）增强了BMSCs的体外软骨分化，并上调了aggrecan、COL-Ⅱ等软骨形成相关标记分子的表达，进一步研究发现miR-26b可直接靶向抑制Wnt的3’非翻译区。这些结果表明miR-26b可能通过靶向Wnt/β-catenin信号通路抑制BMSCs体外软骨分化过程。Zhang等[14]使用miR-410转染OA患者BMSCs后发现COL-Ⅱ、软骨相关基因性别决定区Y框蛋白9（sex-determining region Y box protein 9，Sox9）、aggrecan和透明质酸合酶2（Has2）的表达增加，Wnt3a蛋白表达降低，以上结果表明miR-410可直接靶向Wnt3a触发Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成软骨分化。

2 BMP/Smad信号通路

骨形态发生蛋白（BMP）是存在于骨基质中的酸性糖蛋白，细胞外BMP配体与Ⅱ型受体结合后，使得Ⅰ型受体磷酸化，从而导致Smad家族磷酸化，磷酸化Smad蛋白（R-Smads）与Smad4结合，形成转录复合物，转位进入细胞核进一步调控相应基因的表达[15]。蛋白质、细胞因子等因素可通过影响BMP/Smad信号通路进而调控BMSCs成软骨分化。Zhang等[16]通过对照实验发现间隙连接蛋白（Cx43）可通过BMP信号通路促进BM-SCs成软骨分化。Lee等[17]使用曲古菌素A（trichostatin，TSA）诱导人BMSCs成软骨分化过程，实验发现TSA可导致软骨标记物（Sox9、aggrecan和COL2A1）的基因表达降低，而BMP4和成纤维细胞生长因子受体（FGFR）3的表达升高，这说明，TSA可能通过BMP信号通路抑制人BMSCs成软骨分化。Zhou等[18]使用Smad通路激活剂kartogenin（KGN）诱导BMSCs，发现KGN可通过激活BMP/Smad通路诱导内源性BMSCs选择性分化为软骨细胞，促进软骨的再生。Pfeifer等[19]使用TGF-β、地塞米松、BMP4及TGF-β抑制剂刺激BMSCs成软骨分化过程，结果表明BMSCs成软骨分化的增强效果是通过激活促肥厚的BMP信号和减少抗肥厚的TGF-β信号两种机制共同实现的。Ying等[20]通过对照实验发现高表达TGF-β1的BMSCs含有更多的GAG及COL-Ⅱ，TGF-β1可修复软骨缺损，且可能与Smad信号通路和Hippo信号通路密切相关。

3 MAPK信号通路

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activation protein kinase，MAPK）信号通路共有四个级联反应，包括细胞外信号相关激酶（extracellular signal-related kinase，ERK）1/2、Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）1/2/3、p38 MAPK和ERK5。物理、药物、细胞、细胞因子、RNA、基因等因素可通过影响MAPK信号通路进而调控BMSCs成软骨分化。Rieder等[21]通过增强软骨细胞培养过程中活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平发现ROS水平的增加抑制了GAG和COL-Ⅱ的形成，ROS激活了包括PI3K/AKT和MAPK/ERK在内的信号通路，这表明ROS可能通过MAPK信号通路抑制BMSCs成软骨分化。Kadir等[22]使用含电纺纤维的培养基诱导BMSCs软骨分化过程，结果表明电纺纤维可能通过ERK和FAK信号通路促进BMSCs成软骨分化。Qi等[23]的研究发现高糖（high glucose，HG）可导致p38 MAPK磷酸化并且显著抑制COL-Ⅱ和aggrecan的表达，而这一作用可被p38 MAPK抑制剂SB203580减弱，以上结果表明HG可能通过MAPK信号通路抑制BMSCs成软骨分化。Cao等[24]使用花椒毒素（xanthotox-in，XAT）治疗骨关节炎后，发现XAT抑制了Runx2等软骨肥大标志物的表达，并且降低了p38 MAPK的活化，这表明XAT可能通过MAPK通路维持再生软骨的软骨细胞表型。Ye等[25]使用内源性的生长激素促分泌受体配体Ghrelin诱导大鼠BMSCs软骨分化过程，研究发现Ghrelin可促进ERK1/2、p38、JNK的磷酸化状态以及COL-Ⅱ的表达水平，这表明Ghrelin促进BMSCs成软骨分化主要是通过ERK1/2途径实现的。Qiong等[26]使用滑膜间充质干细胞（synovial mesenchymal stem cells，SMSCs）刺激大鼠BMSCs成软骨分化过程，发现MAPK信号通路被激活，aggrecan、Sox9和COL2A1等软骨生成标志物的表达均被上调，这表明SMSCs可能通过激活MAPK信号通路促进大鼠BMSCs成软骨分化。Wang等[27]通过动物实验发现丙酮酸脱氢酶激酶（pyru-vate dehydrogenase kinase，PDK）2可增强所有软骨生成标志物的mRNA表达，同时促进JNK、p38 MAPK和ERK mRNA和蛋白表达，以上发现表明PDK2可能通过MAPK通路促进BMSCs成软骨分化。杨海杰等[28]发现在BMSCs体外向软骨细胞分化过程中，白细胞介素（interleukin，IL）-6基因表达水平下调，重组IL-6可诱导MAPK/ERK信号通路活化并降低Runx2和Sox9的表达，而加入ERK信号通路特异性阻断剂后Runx2和Sox9的表达恢复正常，以上结果表明IL-6可能通过激活MAPK信号通路抑制BMSCs成软骨分化。Yang等[29]发现长链非编码RNA（lncRNA）SNHG5可以通过miR-23a-3p抑制BMSCs软骨分化转录因子Sox6/Sox5的表达，并且lncRNA SNHG5过表达可激活JNK/MAPK/ERK通路，以上发现说明lncRNA SNHG5可能通过JNK/MAPK/ERK通路靶向Sox6/Sox5抑制人BMSCs成软骨分化。班彤彤等[30]发现Jag1基因敲除小鼠早期软骨细胞及肥大软骨细胞数量下降，并伴有ERK1/2蛋白磷酸化水平下降及JNK蛋白磷酸化水平上升，这表明Jag1基因敲除可通过抑制ERK1/2信号通路，激活JNK信号通路共同抑制小鼠BMSCs软骨分化。

4 PI3K/AKT信号通路

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-ki-nase，PI3K）可分为3类，I类目前研究比较广泛，由调控亚基p85和催化亚基p110组成。PI3K募集到活化的受体后，磷脂酰肌醇-4，5二磷酸（PIP2）被p110亚基磷酸化，形成磷脂酰肌醇-3，4，5三磷酸（PIP3），PIP3进一步影响AKT信号通路进而调控BMSCs成软骨分化[31]。蛋白质、细胞因子等因素可通过影响PI3K/AKT信号通路进而调控BMSCs成软骨分化。Zhang等[32]通过动物实验发现4-氨基联苯（aminobphenyl，ABP）可在体外诱导小鼠BMSCs向软骨分化和增殖，促进软骨修复，同时激活PI3K/AKT通路。Lu等[33]研究了神经生长因子（nerve growth factor，NGF）对BMSCs成软骨分化的作用，发现经NGF处理后纤维软骨标志物I型胶原和终末软骨细胞分化的关键蛋白Runx2的表达明显降低，这表明NGF具有软骨特异性，其潜在机制显示NGF可能通过结合其特异性受体激活PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路促进BMSCs成软骨分化。Wei等[34]发现Atst-trin蛋白可刺激软骨生成，并加速软骨修复，其作用主要是通过肿瘤坏死因子受体2启动AKT信号通路实现的。Wu等[35]使用自噬γ-氨基丁酸受体相关蛋白联合BMSCs衍生分化软骨细胞治疗大鼠OA模型，发现其可抑制PI3K/AKT/mTOR通路并显著提高了COL-Ⅱ和Sox9的水平。Yang等[36]的实验表明IL-8可通过PI3k/AKT信号通路在体内和体外促进人BMSCs成软骨分化。

5 TGF-β信号通路

转化生长因子（TGF）-β家族包含30多种结构相关蛋白质，配体通过细胞表面Ⅰ型受体和Ⅱ型受体结合形成复合物，随后信号可通过Smad信号通路传递，还可以通过Ⅱ型受体和Ⅰ型受体相互作用激活“非Smad信号通路”。此外，TGF-β也可与BMP受体结合激活MAPK和P13K通路[37]。物理、蛋白质、RNA等因素可通过影响TGF-β信号通路进而调控BMSCs成软骨分化。Chen等[38]的实验表明使用脉冲磁场（pulsed magnet field，PMF）可上调Sox9和COL2A1等软骨标记物的表达，并通过激活TGF-β/Smad信号通路改善BMSCs的软骨生成。Ye等[39]使用柚皮苷联合BMSCs治疗兔软骨缺损模型，发现其在关节结构修复和软骨质量方面均表现出满意的治疗效果，同时COL-Ⅱ蛋白表达水平升高，TGF-β3和Sox9的免疫染色增强，这表明Nar可能通过激活并持续调控TGF-β信号通路增强BMSCs成软骨分化。Zhao等[40]使用TGF-β通路抑制剂Repsox刺激牛BMSCs，发现Repsox减弱了BMSCs的软骨分化，并伴有TGF-β通路中Smad2的表达量的减少和Smad3/4的表达量的增加。Anderson等[41]发现在人BMSCs体外软骨形成过程过表达miR-483可使软骨细胞特异性基因的表达水平和软骨基质的产生降低，并且TGF-β通路成员Smad4的表达水平下调，这表明miR-483可能通过TGF-β信号通路抑制BMSCs成软骨分化。Ander-son等[41]发现肥大软骨细胞中miR-483的表达相对于增殖和分化软骨细胞显著降低，在人BMSCs中过表达miR-483后发现软骨细胞基因表达和软骨基质的产生降低，并且Smad4蛋白表达水平下调，以上结果表明miR-483可能通过抑制TGF-β信号通路进而抑制人BMSCs成软骨分化。

6 Notch信号通路

Notch信号通路由Notch受体、配体、转录因子及下游靶基因组成。当配体被激活后，Notch蛋白会经历两次蛋白水解裂解，释放出细胞内的结构域（NICD）进入细胞核与DNA结合蛋白以及共激活因子相互作用，进而促进靶基因的转录以达到调控BMSCs成软骨分化的作用[42]。Zhang等[43]使用Notch抑制剂（DAPT）联合p38MAPK抑制剂（SB203580）治疗兔膝关节关节软骨缺损，发现软骨细胞恢复情况有明显改善，关节软骨空腔率明显降低，软骨细胞的吸光度值明显升高，这表明抑制Notch/p38 MAPK信号通路可促进BMSCs成软骨分化。张永强等[44]的实验表明肝X受体的激活可修复丙泊酚引起的BMSCs抑制作用，并且可被Notch通路抑制剂所阻断，这表明肝X受体可能通过Notch信号通路促进BMSCs成软骨分化。

7 NF-κB信号通路

核因子（Nuclear factor，NF）-κB是一种可诱导的转录因子，NF-κB二聚体通过与抑制性IκB蛋白相互作用存在于细胞质中，受到刺激后IκB被IκB激酶磷酸化，并被蛋白酶体降解，游离的NF-κB复合物可移位到细胞核，与核内DNA上的特异序列相结合，促进相关基因的转录达到调控BMSCs成软骨分化的作用[45]。物理、蛋白质、RNA等因素可通过影响NF-κB信号通路进而调控BMSCs成软骨分化。Liao等[46]使用低强度脉冲超声（low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS）介导BMSCs来源的外泌体，发现LIPUS可促进软骨再生，增加软骨细胞增殖和细胞外基质合成，抑制炎症反应，并抑制NF-κB通路的激活，这表明LIPUS可通过抑制NF-κB信号通路促进BMSCs成软骨分化。Jiang等[47]发现不同硬度的新型静电纺丝（PC）可分别在体内外诱导BMSCs软骨分化，并且可特异性阻断NF-κB信号通路进而抑制炎症反应，这表明PC可能通过阻断NF-κB信号通路促进BMSCs成软骨分化。胡涂[48]的研究发现硫酸镁可通过抑制NF-κB信号通路的活化调节巨噬细胞的极化及其炎性细胞因子释放，进而形成良好的免疫环境以促进BMSCs的成软骨分化。程鹏等[49]通过对照实验发现GSK-3β抑制剂氯化锂（LiCl）可升高炎性环境中BMSCs的GAG含量以及Sox9、COL-2a、aggrecan的mRNA表达水平，并使NF-κB蛋白表达增多，这说明LiCl可能通过抑制NF-κB通路促进BMSCs在炎性环境下成软骨分化。Tao等[50]研究了人BMSCs来源的外泌体miR-361-5p在OA中的作用，发现miR-361-5p可能通过抑制NF-κB信号通路影响BMSCs成软骨分化，减轻软骨细胞损伤。Sun等[51]发现miR-320c的表达在人BMSCs成软骨分化的中期增加，晚期减少；细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）6的表达在人BMSCs软骨分化的中期下降，在晚期上升，且miR-320c与CDK6 mRNA的3’端结合调节CDK6的表达进而调节NF-κB信号通路，以上结果表明CDK6和miR-320c可通过NF-κB信号通路共同调控人BMSCs成软骨分化。

8 Rho/ROCK1信号通路

Rho-GTP酶类（Rho-GTPases）是Ras同源蛋白家族之一，Rho-GTPases的三个被熟知的成员是RhoA、Rac1和Cdc42；Rho相关蛋白激酶（Rho-associated ki-nase，ROCK）属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族。RhoA作用于ROCK以达到调控BMSCs成软骨分化的作用[52]。杨自权等[53]通过对照实验发现等轴周期性牵张应变刺激可升高小鼠BMSCs成软骨分化过程中GAG的分泌量及Sox9、COL-ⅡmRNA表达量，而降低ROCK1 mRNA表达量，这说明等轴周期性牵张应变刺激可能通过抑制Rho/ROCK1信号通路进而促进BMSCs成软骨分化。

9 其他信号通路

除上述信号通路外，国内外研究还表明Hedgehog信号通路、信号转导及转录激活因子（signal transduc-tion and activator of transcription，STAT）3信号通路、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）/FGFR2信号通路、印度豪猪蛋白（indian hedgehog，IHH）/甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormone-re-lated protein，PTHrp）信号通路及Rac1信号通路也可能参与调控BMSCs成软骨分化[54-56]，但目前对这些信号通路及相关调控机制研究较少。

10 总结与展望

综上所述，BMSCs成软骨分化过程涉及许多信号通路，多种影响因素可通过这些信号通路对BMSCs成软骨分化产生正向或负向的调控，其过程极为复杂，复杂性主要体现在以下三个方面：1.各种信号通路并非互相独立，它们通过细胞因子、蛋白质等物质相互连接形成复杂的调控网络；2.一种信号通路可被多种影响因素调控，最终产生的效应因作用靶点以及具体机制的差异而不同；3.同一种影响因素可作用于多种信号通路，使得多种信号通路在不同空间及时间被激活，最终达到调控BMSCs成软骨分化过程。目前对于大多数信号通路的调控机制已经有了初步的认识，且不断有研究发现新的调控机制及作用靶点，但由于BMSCs成软骨分化过程涉及大量影响因素及信号转导通路，多种调控因素的具体作用靶点及其对整个调控网络的整体作用研究仍不明了，且大多数研究停留在动物实验水平。如何通过某一影响因素精准调控BMSCs成软骨分化并应用于临床是当下研究的热点。随着分子生物学的不断发展及基础研究的不断推进，对BMSCs成软骨分化过程调控网络的认知会逐步清晰，进而达到精准干预其过程的程度，这将为软骨病变和骨关节炎等疾病带来新的、更有效的治疗方式。