新型冠状病毒非人灵长类动物感染模型的评价指标

唐 定张瑞安卢 佳李新国

(武汉生物制品研究所有限责任公司生物安全三级实验室,武汉 430207)

一种被命名为SARS-CoV-2 的新型冠状病毒爆发,导致呼吸系统疾病,病死率约为2.2%[1]。 我国将SARS-CoV-2 按照第二类病原微生物进行管理,涉及病毒培养和动物感染实验则必须在生物安全三级或以上级别实验室进行[2-3]。 尽管人类患者的数量非常的庞大,但SARS-CoV-2 某些方面的发病机制和疫苗的前期评估只能在动物感染模型中才能够实现反复采样和病理解剖。 因为非人灵长类动物(non-human primates,NHP)在亲缘关系上与人类非常接近,并且生理结构和解剖病理结构等都与人类十分类似,所以疫苗或药物一般会选择NHP 进行临床前研究[4-5]。 在非人灵长类动物新冠病毒感染模型研究中发现,SARS-CoV-2 能够导致恒河猴的呼吸系统疾病,但NHP 感染新冠病毒后大多表现为轻度到中度的临床症状,并且在感染后1 周左右开始恢复[6]。 因此,单一的评价指标难以准确判断实验猴的感染阶段和感染模型的建立是否成功,正确选择能观察或检测表现疾病关键特征性的指标不仅能够节省人力、物力和时间,也更能保证实验结果的有效性。 新冠病毒非人灵长类动物感染模型关键特征性评价指标包括临床表现指标、影像学诊断、血液学指标、病原学指标、病理学指标、免疫学指标等,结合这些指标综合判断动物感染模型的建立是否成功对后续实验结果的分析至关重要[7-8]。

1 临床表现指标

临床评分是对实验动物的一些主要症状、体征和生理参数等进行加权或赋值,从而量化评价疾病的严重程度,预测后续发展,也能控制研究时的组间可比性[9]。 实验表明,非人灵长类动物在感染新冠病毒后会产生与人类患者相似的临床症状,主要表现为呼吸模式的变化、弓背姿势、体表苍白、脱水、食欲下降、偶尔咳嗽和体温变化等[6]。 对NHP感染新冠病毒后的临床症状进行赋值,建立临床评分标准,再根据标准对实验猴进行临床评分,其结果可以有效评估实验猴的感染阶段,有助于判断实验进程和实验终点(见表1)[6]。

2 影像学诊断

计算机断层扫描(CT)和X 射线检查是影像学检查中非常重要的检查方法。 在新冠病毒感染早期,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法很容易出现假阴性[10],因此,识别该病的早期影像表现及临床特征在新冠肺炎诊断方面具有重要意义。 临床诊断结果也证明使用CT 或胸部X 射线检查能对新冠病毒患者进行有效诊断,其中CT 通常会产生更准确的结果。 人类患者的影像特征包括单发或散在磨玻璃密度阴影,病变部位主要分布在胸膜下缘或肺中央,伴随征象包括胸腔积液、纵隔及肺门区淋巴结增大等[11]。 通过制定新冠病毒非人灵长类动物感染模型的肺部CT 评分方法,能够半定量分析肺内病变程度,评分标准为:无异常密度影,0分;存在少量异常密度影,累及面积＜5%,1 分;累及面积＜25%,2 分;累及面积＜50%,3 分;累及面积＜75%,4 分;累及面积＞75%,5 分[12]。 根据CT 评分结果能够客观的评价实验猴的感染阶段,及时调整实验方案,取得更加理想的实验结果。

3 血液学指标

3.1 血常规检验

血常规是临床检测中应用最普遍的检测项目,其中外周白细胞计数、中性粒细胞与淋巴细胞比率(NLR)、衍生 NLR 比率(d-NLR,中性粒细胞计数除以白细胞计数减去中性粒细胞计数的结果)、血小板与淋巴细胞比率(PLR)和淋巴细胞与单核细胞比率(LMR)是炎症反应的指标[13]。 对动物感染模型临床检查中收集的血液进行血常规分析显示,大多数实验猴的单核细胞和中性粒细胞计数都在感染后短暂上升,然后恢复到基线水平;淋巴细胞则短暂下降再恢复;所有动物都观察到红血细胞压积、红细胞计数和血红蛋白下降,网织红细胞的百分比和计数也有所下降[6]。 淋巴细胞数量的下降与COVID-19 感染的严重程度成正比,并且该疾病的存活率与淋巴细胞尤其是T 淋巴细胞的更新能力有关,这对摧毁受感染的细胞至关重要[14]。 近年来,有研究表明平均血小板体积(MPV)可能是预测肺炎患者病情发展及预后的一个指标[15]。 研究发现NLR 也可用作评估COVID-19 患者的预后情况和临床症状的严重程度,NLR 与COVID-19 的严重程度呈正相关[12]。

3.2 血液生化检测

通过对临床病例分析发现,部分新冠患者的肝功能指标出现异常,主要表现为谷草转氨酶升高,谷丙转氨酶升高,谷草转氨酶和谷丙转氨酶比例异常,乳酸脱氢酶升高;但这不是普遍现象,与感染的毒株和患者年龄有较大关系[16]。 血尿素氮和血清肌酐都是肾损伤的常规指标,现有数据表明,新冠患者中急性肾损伤(AKI)的患病率相对较低,各项研究结果显示在0.5%～19.1%之间[17]。 但是,在新冠病毒非人灵长类动物感染模型中,生化指标的变化较小,肾功能和肝功能的标志物基本保持不变[18]。

4 病原学指标

Real-time PCR 是世界卫生组织(WHO)、中国国家卫生健康委员会等单位推荐的新冠肺炎确诊的标准之一,能够高效处理较大数量样本[19]。 在恒河猴的新冠感染模型中,鼻拭子、咽拭子和支气管肺泡灌洗液中的病毒载量都很高,并且能够从感染早期的鼻拭子、咽拭子和肺泡灌洗液中分离出新冠病毒,也能从肺组织匀浆上清中分离出新冠病毒[6];在呼吸系统及其附近的淋巴结中不仅检测到了高病毒载量,还检测到了新冠病毒的mRNA,这表明新冠病毒在呼吸系统中有较高的复制活性[20-21]。通过新冠病毒的核酸检测,可以有效指示新冠病毒能够侵入的组织器官以及在其中的病毒载量,这对疫苗的免疫保护力评价、病毒感染模型的构建和其它相关生物或化学制剂的作用研究都至关重要。

5 病理学指标

常用的病理学技术有苏木精-伊红(HE)染色和免疫组化技术,HE 染色可以观察细胞结构、组织层次,对组织器官的病理学诊断非常重要;免疫组化染色技术能对新冠病毒抗原进行定位、定性及相对定量的研究[22-23]。 迄今为止描述的COVID-19 肺组织病理学表现在很大程度上是非特异性的,包括水肿、蛋白质渗出物、伴有透明膜形成的弥漫性肺泡损伤 (DAD)、反应性肺细胞增生、以淋巴细胞为主的间质单核炎性浸润和多核巨细胞,通常没有出现病毒致细胞病变的变化或特性核内或胞浆内病毒包涵体[24-30]。 然而, 血管血栓形成似乎在COVID-19 患者的肺中更为常见[31]。 研究发现,非人灵长类动物新冠病毒感染模型中的病理学变化主要表现为以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润,形成间质性肺炎;同时在多个组织器官中检测到新冠病毒抗原,包括整个呼吸道、扁桃体、纵膈淋巴结、肠系膜淋巴结、颈部淋巴结、胃肠道,在部分实验动物的心脏中也检测到了新冠病毒抗原[6,20]。

6 免疫学指标

6.1 细胞免疫

细胞因子风暴被认为是急性呼吸窘迫综合征和多器官衰竭的主要原因之一,它在疾病加重过程中起着重要的作用。 临床研究已经证实COVID-19的危重症患者体内存在细胞因子风暴[32]。 研究发现,与非重症患者相比,重症监护病房患者血浆中IL-2、IL-7、IL-10、GCSF、IP-10、MCP-1、MIP-1a 和TNF-α 的水平更高,提示重症患者体内可能存在细胞因子风暴[33-34]。 尽管呼吸道中的病毒滴度相似,但感染SARS-CoV-2 的老年非人灵长类动物比受感染的年轻非人灵长类动物更容易出现免疫失调,导致更严重的临床症状,可能是过度的炎症反应而不是高病毒滴度导致老年非人灵长类动物的死亡[35-38]。 以上研究结果表明,细胞因子风暴与疾病严重程度呈正相关,因此在新冠病毒非人灵长类动物感染模型建立过程中监测实验猴的细胞因子水平有助于判断感染情况和疾病发展阶段。

6.2 体液免疫

大多数COVID-19 患者在出现症状后1～2 周内可检测到抗体反应[39]。 具体而言,在出现临床症状的第2 天能够检测到IgA 抗体,在临床症状出现后的第5 天能够检测到IgM 和IgG 抗体[40-43]。 最近的研究表明,中和抗体水平与COVID-19 患者的严重程度密切相关,并且抗体反应在感染后数周内消退[44]。 此外,与有症状的个体相比,无症状个体的中和抗体水平下降得更快,并且水平较低[45]。 在新冠病毒恒河猴感染模型中,血清中IgG 抗体水平在感染后第7 天快速上升,在感染后第14 天达到峰值;中和抗体水平在感染后第10 天开始迅速上升,在感染后第15 天左右达到峰值[6]。 监测实验动物血清中抗体水平的变化有助于判断其感染阶段和评估疫苗的免疫保护力。

6.3 固有免疫

固有免疫,即非特异性免疫,包括皮肤、粘膜、血脑屏障、固有免疫细胞等。 作为基础保护屏障,虽然不存在病原特异性,但稳定性强,同时涉及到的免疫细胞种类繁多,因此同样具有重要的检测意义。 采集黏膜拭子是对固有免疫系统指标监测的最常见途径,同时对相关免疫细胞,如单核-巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等的变化趋势检测也尤为重要。 研究发现SARS-CoV-2 能够侵入大脑并感染脑血管内皮细胞,导致动物模型中的脑损伤,但是病毒如何进入大脑的机制尚未可知[46]。

7 总结

非人灵长类动物对大多数人类致病性病毒都具有易感性,可以很好地模拟人类感染病毒后的临床症状和病理变化等,非人灵长类动物感染模型对研究疾病的发病机制,疫苗、药物的评价都发挥着非常重要的作用。 但是非人灵长类动物繁殖周期长,资源比较稀缺,并且成本高昂,所以选择合适的评价指标以正确评估动物模型是否成功建立,从而获得准确、有效的实验结果才能减少不必要的重复实验。 临床表现指标、影像学诊断、血液学指标、病原学指标、病理学指标、免疫学指标对评价新冠病毒非人灵长类动物感染模型的建立具有重要作用。