唇腭裂小鼠模型的研究进展

马亚萍 吴镝

【提要】 唇腭裂属于最常见的先天性颌面畸形，在亚洲人群中的发病率较高。在胚胎发育过程中，小鼠与人类颌面部的发育过程有许多相似之处，因此唇腭裂 小鼠模型一直是研究人类唇腭裂疾病的重要工具。小鼠模型拥有数量多、寿命长、生长周期短、易获得等一系列优势，但也存在模型类型有限等问题。目前，建立唇腭裂小鼠模型的方法很多，较常用的有外科手术建立唇腭裂小鼠模型；运用基因工程技术（Genetic engineering technology）建立唇腭裂小鼠模型，如基因敲除技术、转基因技术等；运用致畸剂作用于孕鼠（如地塞米松、二噁英等），从而影响胚胎小鼠的发育，以建立唇腭裂小鼠模型等。本文就目前建立唇腭裂小鼠模型的方法进行综述。

唇腭裂是最常见的颌面部先天畸形，在世界范围内发病率大约为14.92/10 000，亚洲人群的发病率大约是1.19/1 000，高于非洲人及高加索人[1]。唇腭裂的分类方法众多，如根据是否伴有身体其他畸形，唇腭裂可分为综合征型唇腭裂（Syndromic cleft lip and palate，SCLP）以及非综合征型唇腭裂（Non-syndromic cleft lip and palate，NSCLP）；根据组织胚胎来源不同，唇腭裂还可分为单纯腭裂、唇裂（伴或不伴有腭裂）。

唇腭裂的病因和遗传与环境因素相关。遗传学研究已经定位到多个与唇腭裂发生发展有关的基因和区域，较明确的有IRF6、VAX1、8q24 等。各类动物模型成为探究唇腭裂发生发展和手术治疗的重要研究方法。常用的动物模型有灵长类动物，以及大鼠、猫、犬和兔等。这些动物模型各有优势，其中灵长类动物的面部形态与人类最为接近，但是费用高、样本量少、性价比低；猫与人类颅颌面生长机制相似；小鼠则是最广泛应用的动物模型之一[2-3]。

1 唇腭裂小鼠模型的建立方法

小鼠胚胎唇腭部的发育过程与人类相似，影响唇腭部发育的因素复杂。小鼠上腭的生长发育过程发生在胚胎的第11.5～17.5 天；第11.5 天腭突开始发育；第12.5 天时腭突开始垂直向下生长；第14.5 天时，双侧腭突已发育至水平位置；第15.5 天时，双侧腭突开始融合；第17.5 天时双侧腭突融合基本完成。在建立唇腭裂小鼠模型的过程中，我们可以通过外科手术或是影响胚胎发育的方式来完成模型的建立。

1.1 后天性唇腭裂小鼠模型的建立

通过外科手术的方式建立唇腭裂小鼠模型，主要分为两种：①有裂模型，通过外科手术将唇与腭板离断形成缝隙，以模仿先天性唇腭裂所造成的颅面畸形；②无裂模型，借助外科手术模拟唇腭裂治疗过程中的某一阶段唇腭部的形态，如模仿Langenbeck 腭裂修复术式所造成的减张切开创面和手术损伤后的软腭[3-4]。

1.2 先天性唇腭裂小鼠模型的建立

先天性唇腭裂小鼠模型的建立对于唇腭裂的病因学研究及其发生发展过程的研究更具价值。常用方法：①通过各种方式培育出唇腭裂发生率高的小鼠品系；②运用基因工程技术培育特定基因型的唇腭裂小鼠；③运用致畸剂诱导唇腭裂发生。

1.2.1 筛选出特定种系的小鼠以自然产出先天性唇腭裂幼崽

筛选出自发率高的特定种系小鼠以产出先天性唇腭裂幼崽，如传统的近交系小鼠A/J、CL/Fr 品系具有自发唇腭裂倾向，自然发生率分别为8%～10%和18%～26%[4]。研究表明，用七氟烷影响A/J 小鼠的胚胎发育过程时，A/J 小鼠的唇裂发生率可达50%左右，且A/J 小鼠的畸形率会随着七氟烷浓度的升高而略有增加但并不显著[5]。CL/Fr 小鼠的唇裂发生率只有23%，而运用6-AN 处理后发生率高达94%，可能是6-AN 使上皮细胞表面光滑，造成细胞间连接减少，同时促进细胞死亡；并且还可能导致外鼻突及内鼻突缩小，影响鼻突的正常融合；此外，还可导致上皮细胞及间充质细胞密度增加等细胞改变[6]。FVB 小鼠、A/WySn 小鼠也是常用的自发唇腭裂小鼠模型。

1.2.2 运用基因工程技术建立唇腭裂小鼠模型

1.2.2.1 唇腭裂基因工程小鼠的制备方法

主要通过基因工程技术手段，如基因敲除、条件性基因敲除、转基因、基因敲入等，对小鼠基因组进行一定的人为干预，由此产生各种表型的唇腭裂小鼠模型。

基因敲除技术的应用最为广泛，即将外源性基因插入靶基因的特定位点，造成靶基因失活，从而形成特定的唇腭裂小鼠模型。如用一个含有lacZ 基因以及新表达盒的目的基因插入表达载体Osr2 外显子中，置换出部分外显子，导致Osr2基因失活，然后把表达载体线性化通过电穿孔的方法注入到囊胚的ES 细胞中，从而得到F0 嵌合体小鼠，进行不断的交配筛选而获得Ors2tm1Jian/tm1Jian纯合小鼠[7]。

条件性基因敲除技术目前以趋于完善，可使靶基因的表达拥有时空特异性。其中较常见的便是Cre-loxP 小鼠的应用，即让GeneFlox/+小鼠（靶基因侧翼含有成对的loxp 位点的杂合小鼠）与组织特异性Cre+的工具小鼠交配后，通过一系列的杂交选育获得突变小鼠，然后通过诱导可在特定的组织或细胞中敲除目的基因，如在神经嵴中特异性敲除eprhin-B1基因，从而获得具有组织特异性的eprhin-B1-/-唇腭裂小鼠模型。

转基因技术是指用显微注射针将线性化的外源DNA 片段直接注入小鼠受精卵的原核中，使外源基因随机整合到小鼠基因组中而获得转基因小鼠。如TTF-2 转基因小鼠模型的制备，先选取TTF-2 为目的基因片段，建立表达载体pBROAD3-TTF-2，将促排卵雌鼠与雄鼠交配后得到受精卵，通过显微注射技术将表达载体置入受精卵内，运用PCR 技术及Southern blot 技术，发现基因表达阳性的小鼠中一部分为唇腭裂表型。

1.2.2.2 唇腭裂基因工程小鼠的形成机制

腭板的生长可粗略分为6 个期，分别是发生期、垂直生长期、上抬期、水平生长期、融合期和分化成熟期。这些阶段受到影响有可能形成唇腭裂小鼠。①影响腭板生长，如Msx1-/-小鼠。Msx1 主要介导上皮细胞与间质细胞之间的相互作用，在颅面骨骼及牙齿的发育中起到重要作用。纯合Msx1-/-小鼠会在刚出生后24 h 内死亡。其引起腭裂的主要机制是前腭间质细胞的增殖受损，分子机制可能是由于缺乏Bmp4 的表达，而使Msx1-/-小鼠重新表达Bmp4 可以减少Msx1-/-小鼠的腭裂表型及新生鼠死亡[8]。除了完全继发腭裂，Msx1-/-小鼠还会出现其他的颅面畸形。这也是其引起继发腭裂的原因之一。其机制可能是影响了上颌骨的牙槽突及牙的发育，这些结构都紧邻腭板，在一定程度上也影响腭板的生长[9]。有研究表明野生型小鼠中Ors2 基因表达于上颌中部，并在腭突生长时表达强烈，至腭突上抬及融合时其表达下降[10]。此外常见的小鼠模型还有EphB1-/-、EphB2lacZ/lacZ;EphB3-/-小鼠等。②影响腭板抬升，细胞迁移在腭板的定向抬升中扮演重要角色，Wnt5a 在细胞迁移中发挥重要作用。Wnt5a-/-小鼠呈现出完全继发腭裂。研究表明，Ror2-/-小鼠也呈现出完全继发腭裂表型[11]。其主要机制可能为Wnt5a 与Ror2 相互作用激活非经典的Wnt 信号通路，在腭前后轴内对细胞迁移产生趋化作用从而阻碍了腭后部细胞向前迁移，中间部细胞向两侧迁移。此外常见的小鼠模型还有VlK-/-、Adamts9-/-;bt/bt 小鼠等。③影响板融合，有研究表明Wnt9a-/-、Ror1hyp/hyp、Ror1hyp/hyp;Wnt9a-/-、Ror2-/-、Ror1-/-基因型小鼠均可产出继发腭裂表型的唇腭裂小鼠。其中Ror2-/-小鼠表现为继发腭裂表型可能是因为Shh 的表达下降[12]。TGFβ/Smads 通路是影响腭板发育的重要通路[13]。其中TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3 均有促进腭板融合的功能。此外还有研究表明TGFβ3-/-的小鼠在胚胎发育第15.5天时腭板的前、中、后三部分均未出现融合，而野生型小鼠在此时已经出现了腭板融合[14-15]。还有Snai1+/-、Snai2-/-、Jeff+/-、Smad2+/-小鼠也是常见的模型。

1.2.3 运用药物诱导建立小鼠的唇腭裂模型

在母体孕期（通常为胚胎发育第12～15 天，此时为小鼠胚胎唇腭部发育的关键时期）给予各类致畸药物，以获得先天性的唇腭裂小鼠模型。药物的种类、剂量，以及给药时间和方式均会影响唇腭裂的表现型。

研究表明，地塞米松可单独致畸小鼠，且小鼠的畸形率受剂量影响。地塞米松达6.0 mg·kg-1时，C57BL/6J 胎鼠的腭裂畸形率可达38%[16]。此外，二噁英和糖皮质激素合用可以提高胎鼠的致畸率[17]，二噁英和糖皮质激素合用的情况下，高剂量一次性给药相较于低剂量连续给药在操作上给孕鼠带来的影响更小，胎鼠死胎率显著降低，孕鼠流产率也较低，腭裂小鼠模型更稳定[18]。维甲酸也是小鼠腭裂模型常用的诱导剂，昆明胎鼠发育第10 天对维甲酸的敏感度最高，当维甲酸剂量为50 mg·kg-1，孕鼠全部存活，死胎率为10.34%，活胎小鼠的腭裂发生率为95.34%，以此浓度建立的腭裂小鼠模型效益较高[19-20]。维甲酸诱导BALB/c 近交系小鼠建立腭裂模型时，在胚胎发育第10 天，一次性管饲维甲酸50 mg·kg-1，小鼠腭裂形成效率较高[21]。不同品系小鼠给予可的松后的致畸率不同，A/J 与SWV 品系小鼠腭裂致畸率可达100%，而其他小鼠（如C57BL/6J、A.B6F1、B6.AF1）的致畸率往往较低，表明小鼠自身基因也是影响腭裂发生率的独立因素。A/J 小鼠的高腭裂产生率可能与腭板融合延迟有关[22]。

2 小鼠模型的优势及劣势

小鼠现作为国内外应用最多的动物模型之一，其优势在于：①小鼠寿命1～3 年，生长周期和孕育周期短；生产数量多，个体差异小；容易获得，易于饲养。②小鼠的早期颅面发育与人类相似，可用于研究人类胚胎唇腭的发育的相关研究。其劣势在于：①小鼠模型并不能准确建立人类唇腭裂中各类综合征型及非综合征型的唇裂或腭裂模型。②部分基因功能繁多，基因敲除后可影响颅面其他部位的发育，从而无法判断其作用究竟是影响了腭板的发育还是因为腭旁组织的畸形而继发腭畸形[23]。③部分小鼠模型胚胎过早，导致无法观察腭板及唇部发育过程，如BMP2 基因敲除小鼠可在胚胎发育第7.5～10.5 天死亡，此时腭板还未发育[24]。

3 总结与展望

目前已经探索了多种小鼠唇腭裂模型，从综合征型至非综合征型唇腭裂模型均有长足的发展，对唇腭裂的病因及治疗研究起到了重要作用。值得注意的是，各类方法建立小鼠唇腭裂模型时胎鼠及新生小鼠死亡率较高，不利于后续进一步的研究。此外，即使小鼠腭裂模型成功建立，但在研究唇腭裂治疗方法、患者智力发展、发音构音功能、心理影响等方面，小鼠模型的作用极为有限，建模的经济效益较低。