湿化学法检测华氏巨球蛋白血症病人血清钙假性增高的原因分析

王中军，张海平,任立晟，张少燕，王盼，初开秋

(青岛大学附属医院检验科，山东 青岛 266003)

目前临床生化测定血清钙主要以偶氮砷Ⅲ法检测为主。该法以特异性好、线性范围广、抗干扰能力强、速度快、对仪器污染小等优点，成为实验室全自动生化分析仪测定血清钙的常用方法。华氏巨球蛋白血症(WM)又称为原发性巨球蛋白血症，是一种B淋巴细胞起源的恶性增殖性疾病，以合成和分泌大量的单克隆IgM以及骨髓中出现淋巴样浆细胞为特征[1]。本实验室在日常工作中观察到，WM病人应用偶氮砷Ⅲ法湿化学方法检测血清钙结果异常增高，甚至出现危急值(>3.5 mmol/L)，而经与临床医生沟通发现病人并没有高钙的现象。为进一步探讨其原因和解决方法，本研究进行了如下试验。现将结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2016—2021年到本院就诊，根据临床表现、免疫分型电泳、骨髓组织活检等临床检查，并排除意义未明的单克隆丙种球蛋白病及其他B淋巴细胞增殖性疾病[2-3]，临床确诊为WM病人15例，临床上均排除甲状旁腺功能亢进及其他恶性肿瘤。另选取健康人15例作为对照。

1.2 检测方法

采集WM病人和健康对照者的空腹静脉血各5 mL，置离心机中分离血清，转速为3 000 r/min，分离时间为15 min。分离出血清各约3 mL，取其中2 mL分别使用日本日立7600型全自动生化分析仪和美国强生Vitros-3500全自动干化学分析仪进行血清钙水平检测；另外的1 mL血清，则使用德国西门子公司Dade Behring BNⅡ免疫生化分析仪测定IgM含量。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 WM病人及健康对照者干、湿化学法所测血清钙水平比较

本文15例WM病人采用湿化学法和干化学法所测血清钙水平分别为(6.34±1.88)和(2.30±0.24)mmol/L，差异有显著性(t=8.6，P<0.01)；15例健康对照者采用湿化学法和干化学法所测血清钙水平分别为(2.32±0.08)和(2.30±0.09)mmol/L，差异无显著性(t=0.5，P>0.05)。

2.2 WM病人与健康对照者血清IgM含量比较

本文15例WM病人血清IgM含量为(42.77±23.64)g/L，远大于本室参考范围(0.4～2.3 g/L)，与15例健康对照者血清IgM含量(1.32±0.42)g/L比较，差异具有统计学意义(t=6.6，P<0.01)。

3 讨 论

全国大部分临床生化实验室采用全自动生化分析仪测定血清钙，检测方法主要以偶氮砷Ⅲ法为主，其优点是特异性好、线性范围广、抗干扰能力强、速度快、对仪器污染少。目前研究报道血清钙测定的干扰因素较少，检验学者的共识为严重脂血标本可以造成钙检测正干扰，某些抗凝剂如草酸盐、柠檬酸盐和乙二胺四乙酸(EDTA)可以造成负干扰。而关于大分子蛋白干扰湿化学法检测血清钙的研究报道很少[4]。本实验室观察到，WM病人采用湿化学法检测血清钙出现结果异常增高的现象，甚至出现危急值，而标本非严重脂血标本。报告危急值后经与临床医生沟通，显示病人并没有高钙血症的现象，即临床上并没有出现疲倦、软弱、乏力、烦渴、尿频等症状。这种假性高钙现象引起检测人员的关注，本研究旨在分析其原因。

人体中血钙有两种存在形式，即非扩散钙和扩散钙，前者指与蛋白质主要是清蛋白结合的钙，后者是离子钙。高钙血症是由于过多钙进入细胞外液，超过了细胞外液钙浓度调节系统的调节能力[5]。其最常见的原因是原发性甲状旁腺功能亢进和恶性肿瘤造成甲状旁腺激素水平过高，过多的甲状旁腺激素既有促进溶骨作用又可促进维生素D的活化，间接促进肠管对钙的吸收，从而导致高钙血症[6-7]；恶性肿瘤细胞可以分泌破骨细胞激活因子，这种多肽因子能激活破骨细胞，也能引起高钙血症[8]。而本研究15例WM病人临床上均排除了甲状旁腺功能亢进及恶性肿瘤等引起高钙血症的因素，15例病人也没有出现疲倦、软弱、乏力、烦渴、尿频等高钙现象，说明实验室检测结果受到干扰。

继续查找原因发现这种假性高钙现象多发生于WM病人，其免疫分型电泳均为IgM型。进一步检索文献发现，1997年JOHN等[9]对2例巨球蛋白血症病人进行血清钙测定，采用不同的检测方法得到不同的结果。其中1例病人使用偶氮砷Ⅲ显色法测定血清钙水平为3.02 mmol/L，使用原子吸收法测定血清钙水平为2.49 mmol/L，采用邻-甲酚酞络合酮比色法测定血清钙水平为2.46 mmol/L。分析不同检测方法结果有差异的原因，可能是由于IgM型M蛋白在弱酸性环境中(偶氮砷Ⅲ所致)产生沉淀，造成血清钙结果的假性增高。而改用邻-甲酚酞络合酮比色法测定可以避免假性高钙结果的产生，因为邻-甲酚酞络合酮比色法是在碱性环境中反应的，不会产生沉淀[10]。BECKMAN公司也注意到了这种干扰因素，在CX7分析手册中提到：“异常免疫球蛋白合成，如多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病等有可能影响偶氮砷Ⅲ法检测结果”。目前有一些改进检测方法是在碱性缓冲液中进行反应，可供参考使用。

本研究结果显示，15例WM病人采用湿化学法所测血清钙假性升高，且WM病人血清IgM含量明显高于健康对照者，差异具有统计学意义。考虑WM属于B细胞淋巴瘤，骨髓中浆细胞样淋巴细胞浸润，并伴有外周血单克隆IgM异常增高[11]，病人血中的异常单克隆M蛋白分子可能结合钙离子发生反应形成沉淀，从而干扰比色反应的检测，导致结果的假性增高，表明湿化学法检测血清钙浓度主要受大分子M蛋白的影响[8]。

干化学法采用多层薄膜的固相试剂技术，其试剂条的分布扩散层能过滤大分子蛋白[12]。所以即使IgM的分子量大于10万，但是经过滤后，该法检测血清钙也不会受到干扰而出现假性增高。

既往有文献报道，这种引起血钙假性增高疾病的免疫分型为IgG型[13]。这与本研究发现的免疫分型均为IgM型不符。由于WM病例罕见，对血清钙检测产生正干扰的原理也不明确，故国内文献少有报道[4,14]。本研究病例数也较少，尚需要继续积累病例进一步研究。

在临床工作中若遇到无症状高钙血症时，应检查病人有无巨球蛋白血症，若血清IgM明显增高，要警惕这种高钙现象可能是假性高钙。可以采用干化学法测定排除假性高钙。有文献报道，先采用聚乙二醇沉淀大分子免疫球蛋白，再测定上清液中的钙含量，可以证明有无假性高钙[15]。也可采用在碱性环境中反应的方法如邻-甲酚酞络合酮比色法测定，但是此种方法因为涉及重金属物质污染环境，目前已被淘汰[16-17]。

综上所述，当WM病人出现高钙血症与临床表现不相符时，应考虑到异常蛋白的影响。可以采用能去除病人血清中大分子蛋白的方法检测血清钙，从而为临床提供真实、可靠的检验结果，防止临床误诊、误治。