基于网络药理学、分子对接技术的四妙勇安汤治疗糖尿病足溃疡机制分析与验证

吴奇，高兆佐，王彬

1山东中医药大学第一临床医学院，济南 250000；2广饶县中医院内分泌科；3山东中医药大学附属医院周围血管科

国际糖尿病联盟（IDF）2021年发布的第十版全球糖尿病地图显示，全球20～79岁的成人中约有5.37亿人患有糖尿病（DM），预计到2045年将上升至7.83亿。糖尿病足溃疡（DFU）是DM患者最常见的并发症之一，也是造成DM患者截肢甚至死亡的重要原因之一。研究发现，DFU患者在高位截肢后第12个月的病死率可达16.7%，第5年的病死率超过50%，DFU造成的病死率甚至高于部分癌症［1-2］。四妙勇安汤最早出现在《华佗神医秘传》，由金银花、玄参、当归、甘草4味药组成，具有滋阴活血、清热解毒的功效，是治疗“脱疽”的经典方。现代药理研究显示，四妙勇安汤具有抗炎、抗凝血、改善血液流变学、保护血管内皮细胞等作用［3-5］。临床研究表明，四妙勇安汤对DFU的治疗效果显著，但具体作用机制尚不明确。2022年2月—6月，本研究在网络药理学的基础上筛选出四妙勇安汤的主要药物成分及关键靶基因，并与疾病靶点交集后，确定白细胞介素6（IL-6）为核心靶点，通过分子对接的方法检测四妙勇安汤的核心活性成分与IL-6的结合程度，并进行细胞实验验证，为临床上采用四妙勇安汤治疗DFU提供了新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料实验动物：选择7～8周龄雄性Wistar大鼠10只，体质量（200±20）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物许可号：SCXK（鲁）2019-0003。细胞：人脐静脉内皮细胞（HUVEC）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。药物：四妙勇安汤（金银花90 g、玄参90 g、当归60 g、甘草30 g）饮片购自山东中医药大学附属医院。主要试剂：逆转录试剂盒购自上海东洋纺生物科技有限公司，IL-6、GAPDH引物序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成，ELISA试剂盒购自杭州多科生物科技有限公司。

1.2 四妙勇安汤治疗DFU的核心靶点分析

1.2.1 四妙勇安汤的有效成分及其作用靶点筛选在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）中，按口服生物利用度（OB）≥30、类药性（DL）≥0.18检索四妙勇安汤相关药物的有效成分及作用靶点，利用Universal Protein数据库（https：//www.uniprot.org）对靶点名称进行标准化。

1.2.2 药物—疾病关键靶点获取以“Diabetic foot ulcer”为关键词，从比较毒理基因组学数据库（CTD）中搜索与DFU相关的靶点，筛选条件为：in⁃ference score≥10。将四妙勇安汤的作用靶点与DFU疾病靶点在韦恩图绘制平台Venny2.1（https：//bio⁃infogp.cnb.csic.es/tools/venny/）取交集，确定关键靶点并绘制韦恩图。

1.2.3 药物—疾病核心靶点筛选及通路富集分析在STRING数据库（https：//string-db.org）中输入四妙勇安汤治疗DFU的关键靶点，获得关键靶点的蛋白质互作（PPI）网络图。将相互连接的靶点导入Cytoscape3.7.1软件，根据自由度（Degree）筛选出排名前十的核心靶点，Degree值越高表示该节点所代表的靶点在网络中的作用越高。将前十位的核心靶点输入Metascape数据平台（https：//metascape.org/），运用京都基因与基因组百科全书（KEGG），以P<0.01为条件，对核心靶点的通路进行富集分析，绘制气泡图。

1.2.4 四妙勇安汤的药物活性成分分析使用Cytoscape3.7.1创建药物—成分—靶点—疾病网络图，图中节点（Node）之间通过边（Edge）来连接，根据Degree值的大小筛选出药物活性成分，选择排名前四的核心活性成分进行后续研究。

1.2.5 四妙勇安汤核心活性成分与疾病核心靶点的分子对接在有机小分子生物活性数据库（Pub⁃Chem）中下载排名前四的核心活性成分的三维结构，并保存为sdf格式；导入到chemdraw3D软件中，利用MM2模块进行能量最小化，获得能量较低的优势构象，并保存为MOl2文件。从蛋白质结构数据库（PDB）中下载疾病核心靶点IL-6蛋白的三维结构，其蛋白质PDB的ID为1ALU。利用Pymol对IL-6蛋白进行可视化，利用Mgtools1.5.6进行加氢，计算电荷，合并非极性氢等前处理后，将配体和受体保存为pdbqt文件。使用Autodock vina1.1.2软件将配体与受体进行分子对接，取最优势构象，利用PYMOL和Discovery Studio进行可视化分析。当分值（结合能）≤-5.0 kcal/mol表明化合物小分子与靶点具有较好的结合能力。

1.3 四妙勇安汤治疗DFU机制的细胞学验证

1.3.1 含药血清和空白血清的制备取10只大鼠，分为两部分，每部分5只。四妙勇安汤由金银花、玄参、当归、甘草组成，比例为3∶3∶2∶1，按照大鼠体表面积换算公式进行换算，两部分大鼠分别给予四妙勇安汤、双蒸水28 g/（kg·d）灌胃［6］，共7 d；末次灌胃后2 h，使用异氟烷进行麻醉，心脏取血后分离收集含药血清和空白血清。

1.3.2 细胞分组处理取对数生长期的HUVEC，以2×105/孔接种于12孔板，使用F12培养基常规培养24 h，吸出培养液。将HUVEC分为低、中、高剂量组和空白对照组，分别加入5%含药血清+95%空白血清、10%含药血清+90%空白血清、20%含药血清+80%空白血清、100%空白血清，每孔100 μL。将各组细胞置于5%CO2细胞培养箱中，37℃条件下孵育24 h。

1.3.3 细胞中疾病核心靶点IL-6 mRNA检测采用实时荧光定量PCR法。取各组细胞，TRIzol法提取总RNA，使用紫外分光光度仪测定RNA的浓度和纯度。按照说明书合成cDNA，使用Ultra SYBR Mix⁃ture PCR反应体系进行扩增。IL-6上游引物5'-CAATGAGGAGACTTGCCTGGT-3'，下 游 引 物5'-GCAGGAACTGGATCAGGACT-3'；GAPDH上游引物5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。采 用2-ΔΔCt法 计 算IL-6 mRNA相对表达量。

1.3.4 细胞上清液中疾病核心靶点IL-6蛋白检测采用ELISA法。取各组处理后的细胞，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-6蛋白表达，通过微板读数器测量双波长（450、630 nm）下的吸光度（OD）值，绘制标准曲线，计算IL-6蛋白水平。

1.4 统计学方法采用Graph Pad Prism7.0统计软件。计量资料采用S-W正态性检验，呈正态分布以±s表示，多组间比较采用方差分析，组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四妙勇安汤的有效成分及其作用靶点分析结果在TCMSP数据库中筛选出金银花、玄参、当归、甘草的有效成分分别为23、9、2、93个，剔除重复成分后，共获得120个有效成分。确定金银花、玄参、当归、甘草的作用靶点分别为126、55、64、125个，剔除重复靶点后，共获得208个作用靶点。见OSID码图1。

2.2 药物—疾病关键靶点分析结果共获得501个疾病靶点，与四妙勇安汤的208个作用靶点取交集，获得关键靶点81个。见OSID码图2。

2.3 药物—疾病核心靶点筛选及其通路分析结果PPI网络图共包含206个节点、778条边（OSID码图3）。拓扑分析结果显示，Degree值排名前十的核心靶点分别为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、肿 瘤 坏 死 因 子（TNF）、IL-6、p53基 因（TP53）、白细胞介素1β（IL-1β）、转录因子AP-1（JUN）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）、前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、转录激活因子3（STAT3）、缺氧诱导因子1亚基α（HIF1A）。KEGG通路富集结果显示共富集到81条相关通路，其中19条与DFU的发生关系密切。核心靶点AKT1、TNF、IL-6、TP53、IL-1β、JUN、CASP3、PTGS2、STAT3、HIF1A分别涉及15、14、13、10、10、8、7、5、5、2条DFU相关通路，见表1；其中IL-6在相关通路富集中排名靠前，在参与多项炎症通路的同时也参与了血管病变、神经病变、感染等重要通路，选择IL-6作为核心靶点进行后续研究靶点。

表1 DFU的主要相关通路

2.4 四妙勇安汤的药物活性成分分析结果药物—成分—靶点—疾病网络图见OSID码图4。四妙勇安汤共102个药物活性成分，MOL000098（五羟黄酮）、MOL000422（山柰酚）、MOL000358（β-谷甾醇）、MOL004328（柚皮素）是四妙勇安汤排名前四的核心活性成分，分别对应101、42、32、17个活性靶点。

2.5 四妙勇安汤核心活性成分与IL-6的分子对接分析结果五羟黄酮能够与IL-6的ASP34、ARG30和LEU33氨基酸形成3个稳定的氢键，其距离分别为2.9、4.0和3.0；五羟黄酮的疏水官能团能够与IL-6的GLN175和LEU178氨基酸形成疏水相互作用，结合能为-6.2 kcal/mol。山柰酚能够与IL-6的LEU33、ASP34和ARG179氨基酸形成4个稳定的氢键，其距离分别为2.9、2.9、3.3和3.4；山柰酚的疏水官能团能够与IL-6的GLN175和LEU178氨基酸形成疏水相互作用，结合能为-6.2 kcal/mol。β-谷甾醇能够与IL-6的ARG182氨基酸形成稳定的氢键，其距离为2.9；β-谷甾醇的疏水官能团能够与IL-6的ARG30、LEU33、ILE36、GLN175、和LYS171氨基酸形成疏水相互作用，结合能为-6.5 kcal/mol。柚皮素能够与IL-6的ASP34和ARG30氨基酸形成2个稳定的氢键，其距离分别为2.8和3.9；柚皮素的疏水官能团能够与IL-6的GLN175和LEU33氨基酸形成疏水相互作用，结合能为-6.4 kcal/mol。见OSID码图5。

2.6 各组细胞IL-6 mRNA及上清液IL-6蛋白表达比较与空白对照组比较，低、中、高剂量组细胞IL-6 mRNA及上清液IL-6蛋白表达均降低，以高剂量组降低最明显（P均<0.05）。见表2。

表2 各组细胞IL-6 mRNA及上清液IL-6蛋白表达比较（-x±s）

3 讨论

研究表明，DFU的发生发展均与炎症反应密切相关，因此抗炎已成为治疗DFU的新方向。本研究网络药理学分析结果发现，IL-6、IL-1β、HIF1A、PTGS2、CASP3、TNF、AKT1均与DFU的发生有着重要联系。对上述核心靶点进行通路富集，得到的81条信号通路中包含炎症通路、神经通路、感染通路、糖尿病并发症等多条与DFU密切相关的通路。值得关注的是，多条DFU相关通路中均有IL-6的参与，这表明IL-6异常表达是导致DFU的关键因素。IL-6是体内重要的炎症因子，在自身或外在因素的刺激下由淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等产生并分泌，是炎症风暴级联反应的重要介质及标志，会诱导促进白细胞、淋巴细胞等多种炎症细胞的聚集和分化，增强自然杀伤细胞的活性，促使炎症细胞释放细胞因子，导致组织损伤溃疡面加重，延长创面愈合时间。因此，阻断IL-6的合成及释放能有效减轻炎症损害的发生和发展［7-9］。

四妙勇安汤具有清热解毒、凉血散瘀之效，是治疗DFU的常用方剂，在临床上疗效显著。本研究分析结果发现，四妙勇安汤中多个有效成分对DFU有治疗作用，其中五羟黄酮、山奈酚、β-谷甾醇、柚皮素是活性较强的核心成分。以往研究显示，β-谷甾醇具有免疫调节、抗氧化、抑制炎症等多种生物活性作用，可提高白细胞介素10的活性，减少TNF-α及白细胞介素1等炎症因子分泌。此外，β-谷甾醇还具有较好的降脂作用，可降低机体对胆固醇的吸收，有效预防动脉粥样硬化，改善局部血运，有利于创面的愈合［10-11］。山奈酚可显著改善小鼠胚胎成纤维细胞的葡萄糖吸收能力，其原因可能与该成分能改善胰岛素敏感性、抑制醛糖还原酶途径及抗炎抗氧化有关，因此能有效抑制DFU的发生与发展［12］。此外，柚皮素、五羟黄酮均具有显著的抗炎作用，其中五羟黄酮可以下调TNF-α、转化生长因子β1（TGF-β1）表达，拮抗IL-1β诱导的细胞炎症和凋亡，而柚皮素具有抗氧化的作用［13-15］。

本研究使用分子对接技术将上述4个核心成分与IL-6进行对接，结合能均<-5 kcal/mol，表明这些小分子化合物与IL-6具有良好的结合活性，对其起调控作用。为了进一步探讨四妙勇安汤对IL-6的调控作用，我们在HUVEC中进行了细胞实验；结果显示随着四妙勇安汤含药血清浓度的升高，HUVEC中IL-6 mRNA及上清液IL-6蛋白表达逐渐下降，以高剂量组下降最明显，推测四妙勇安汤通过抑制IL-6表达从而对DFU发挥治疗作用。值得关注的是，在四妙勇安汤对DFU的治疗作用中，发挥主要作用的是β-谷甾醇、山奈酚、柚皮素和五羟黄酮，这为今后相关药物单体的研究提供了依据。不足的是网络药理学作为一项多靶点、多途径的研究，尽管我们筛查了主要核心靶点为IL-6，并指出四妙勇安汤对DFU的治疗与IL-6关系密切，但药物与靶点之间关系错综复杂，具体作用机制仍需进一步研究。此外，IL-6是一种全身性的炎症因子，尽管有研究表明IL-6会导致微循环局部栓塞，造成组织缺血坏死，但是IL-6对病发处相关因子的影响尚不明了。因此，明确IL-6与DFU发生的具体作用机制，探讨IL-6异常改变的上游机制，阐述核心靶点与疾病之间的因果关系是未来工作的重点内容。