低温等离子体对鲅鱼脂质与蛋白质氧化的影响

姜竹茂，桑晓涵,2，潘芸芸，陈增鑫，王佳媚，位正鹏，杨青，王金梅

1(烟台大学 生命科学学院，山东 烟台，264005)2(海南大学 食品科学与工程学院，海南 海口，570228) 3(荣成泰祥食品股份有限公司，国家马鲛鱼加工技术分中心，山东 荣成，264309)

鲅鱼，又称马鲛鱼或者竹鲛，属鲭科，马鲛属，体形狭长，头及体背部呈蓝黑色，背部略有蓝黑色圆斑点，腹部呈白色，背鳍与臀鳍后有角刺，多分布于北太平洋西部，而中国鲅鱼多产自东海、黄海和渤海[1]。鲅鱼属于海鱼，捕捞后不易存活，通常进行冷藏处理后以冷冻状态销售。鱼体解冻后很容易因微生物生长繁殖而发生腐败变质[2]，非冷冻状态的鲅鱼需要有效控制微生物生长，同时有效保持产品的原有品质。

等离子体是处于高度电离状态的混合物，含有带电粒子、活性粒子和自由基等多种活性成分。近几年，低温等离子体在水产品和肉类食品的保鲜应用研究日渐增多。低温等离子体能够有效抑制草鱼中微生物生长，同时对其品质无明显负面影响；太平洋白虾经低温等离子体处理后在4 ℃下能够保存15 d，且冷藏期间蛋白质与脂质氧化不明显；且低温等离子体对猪肉、鸡肉有良好的杀菌保鲜作用[3-8]。但是，有研究发现低温等离子体处理条件不同，对产品品质影响也不同[9]。

当低温等离子体激发气体中含有氧气和氮气时，处理过程中产生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)，能够与鱼肉中的脂质和蛋白质发生反应，造成不同程度的氧化损伤。脂质氧化由不饱和脂肪酸与活性自由基反应引发，形成不同的小片段成分，表现为不同程度的氧化现象。自由基介导的蛋白质氧化导致多肽链发生氧化断裂、蛋白质侧链氨基酸发生氧化修饰以及蛋白质-蛋白质发生交联。为了研究低温等离子体处理对鱼肉中脂质和蛋白质氧化的影响，本文以不同激发因素条件处理的鲅鱼肉为研究对象，分析处理后鱼肉中硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)、羰基含量、巯基含量以及蛋白表面疏水性变化，探究各处理因素对鱼肉中脂质和蛋白质氧化的影响，进而了解低温等离子体处理对鲅鱼品质的影响，为鲅鱼的非热加工技术提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鲅鱼，采购于海口美兰区海鲜市场。

三氯乙酸，西陇股份有限公司；硫代巴比妥酸、溴酚蓝、考马斯亮蓝G-250，国药集团化学试剂有限公司；PBS，赛国生物科技；牛血清白蛋白、2-硝基苯甲酸(2-nitrobenzoic acid，DNTB)、盐酸胍，北京索莱宝科技有限公司；2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine，DN-PH)，罗恩试剂；乙酸乙酯、尿素，广州化学试剂厂。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BK130/36低温等离子体，美国Phoenix公司；MAP-H360复合气调保鲜包装机，苏州森瑞保鲜设备有限公司；PL303电子分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；IW-86L338超低温冰箱，青岛海尔特种电器有限公司；722G紫外可见光光度计，北京普析通用仪器有限公司；TGL-16MS型台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；HH-2恒温水浴锅，常州金坛实验仪器；DGG-9123A电热鼓风干燥箱，上海森信实验仪器公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验方案设计

鲅鱼去掉鱼头、鱼骨及鱼尾，用清水清洗，洗净后分切成大小基本一致的鱼块(10 g左右)，将鱼块放在塑料包装盒中，充气密封后采用介质阻挡放电系统低温等离子体处理。

(1)充空气密封包装，低温等离子体在40、50、60、70、80 kV，处理3 min，介质阻隔板厚度为2 mm，处理后立即打开包装，取样测定。

(2)充空气密封包装，低温等离子体在70 kV，处理0、1、2、3、4、5 min，介质阻隔板厚度为2 mm，处理后立即打开包装，取样测定。

(3)分别充空气、CO2∶O2∶N2= 80%∶10%∶10%(体积比，下同)、CO2∶O2∶N2= 50%∶10%∶40%包装，低温等离子体在70 kV，处理3 min，介质阻隔板厚度为2 mm，处理后立即打开包装，取样检测。

(4)充空气密封包装，低温等离子体在70 kV，处理3 min，介质阻隔板厚度为2、4、6、8、10 mm，处理后立即打开包装，取样测定。

1.3.2 TBARS的测定

参照GB 5009.181—2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》操作，称取2 g样品放入50 mL离心管中。移取20 mL三氨乙酸混合液，均质，加塞密封后置于恒温振荡器上30 min，温度保持在50 ℃，取出后冷却至室温。6 000 r/min离心15 min，弃去初滤液，准确取上述滤液和标准系列溶液各5 mL分别置于试管中。另取5 mL三氯乙酸混合液作为样品空白对照组，分别加入5 mL硫代巴比妥酸水溶液，加塞混匀后置于90 ℃水浴锅内反应30 min，待冷却至室温后，以样品空白调节零点，于532 nm处测定样品溶液和标准系列溶液的吸光度值。

1.3.3 肌浆蛋白与肌原纤维蛋白提取

1.3.4 蛋白质含量的测定

参考林智[11]的方法，用考马斯亮兰G-250试剂测定。测定595 nm处吸光值，3组平行，取平均值，绘制出标准曲线。

1.3.5 羰基含量的测定

参照孙慧琳等[12]的方法，分别取1 mL肌原纤维蛋白质溶液(肌浆蛋白溶液)于5 mL离心管内，加入1 mL DN-PH溶液(10 mmol/L)，对照组则加入1 mL 2 mol/L盐酸，在暗室处静置1 h。加入1 mL质量分数为20%三氯乙酸溶液，在13 000 r/min条件下离心5 min，收集沉淀，用体积比为1∶1的乙酸乙酯-乙醇等量混合液充分洗涤后，离心3～4次至沉淀无颜色，去除残留的试剂。随后取3 mL 6 mol/L盐酸胍溶液加入沉淀中，38 ℃下水浴15 min后，13 000 r/min离心5 min，取出上清液在370 nm下测定溶液吸光度。

1.3.6 巯基含量的测定

参照孙慧琳等[12]的方法，分别提取1 mL上述操作保留的肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的上清液，将其缓慢加入4 mL 8.0 mol/L 的尿素溶液中，混匀。从中取出2 mL混合液，并滴加0.01 mL DNTB溶液，均匀后静置10 min。在412 nm处测定其吸光值，空白对照组中不添加DNTB。

1.3.7 蛋白表面疏水性测定

实验参照陈晓楠等[13]的方法，并适当修改，取2 mL肌原纤维蛋白提取液和肌浆蛋白提取液，分别加入40 μL 1 mg/mL溴酚蓝溶液，对照组则将2 mL PBS缓冲液加等量的溴酚蓝溶液。静置9 min后，4 000 r/min离心15 min。测定在595 nm下的吸光值。

五是训练组织不经常。网络安全行业自出现伊始，就带着鲜明的个性化、地下化印记。近年来更是发展迅猛，已然形成巨大产业规模。但是网络安全培训却始终缺乏标准化、可复制的培养模式，特别是具备优秀组训能力的师资力量更是一师难求。各级网络民兵自组建以来，按民兵专业分队有关要求落实了集中编组联训。但从训练的组织情况看，共同训练完成较好，专业训练难以深入，基本停留在讲授安全知识、观看教学录像、理论交流发言的老套路，没有打通从理论到实践的路径，缺少模拟实战化网络环境的技战术攻防训练，专业技术能力主要依靠个人在工作岗位上的自学自训，民兵网军的专业训练还没有真正落地。

1.4 数据处理

所有数据均为3次重复的平均值，采用Microsoft Excel 2017进行数据处理，SPSS 20.0 软件进行方差分析和Duncan’s多重分析， 显著性水平P< 0.05，采用Origin 8.5进行做图。

2 结果与分析

2.1 不同处理条件对鲅鱼中TBARS值的影响

鲅鱼中含有丰富的不饱和脂肪酸，容易发生氧化，而低温等离子体处理过程中产生的臭氧和·OH被广泛认为是破坏不饱和脂肪酸中双键的主要物质[14]。脂质氧化最常见的中间产物丙二醛用TBARS值来分析[15]。根据国内外研究，高脂鱼类其TBARS值<5 mg/kg时比较适宜于食用，当TBARS值达到8 mg/kg时不能再被加工或者食用[16]。

从图1-a可知，随着处理电压从40 kV升高到80 kV时，鲅鱼肉中TBARS值显著(P<0.05)增加，从0.694 mg/kg增加到0.986 mg/kg，这与斯兴开等[4]研究草鱼的TBARS值会随着低温等离子体处理电压的增大而增大结果一致。本研究中采用空气作为低温等离子体激发气体，产生具有高氧化活性的基团，促进鱼肉中脂肪酸氧化。同时，低温等离子体激发电压越高，形成的氧化活性粒子种类和数量越多，对鲅鱼肉中脂质氧化的促进作用越明显。

随着低温等离子体处理时间延长，处理后鲅鱼肉的TBARS值显著(P<0.05)增加(图1-b)，当处理时间达5 min时，TBARS值为1.208 mg/kg。低温等离子体处理时间越长其产生的具有氧化作用的活性基团越多，可导致鱼肉中更多的不饱和脂肪酸降解，生成更多丙二醛。类似结果在低温等离子体处理大西洋鲱鱼的研究中有报道[7]。

如图1-c所示，CO2∶O2∶N2=80%∶10%∶10%包装组的TBARS值比空气包装组减少了0.097 mg/kg，降低O2含量、提高CO2浓度，能够减少低温等离子体中含氧活性自由基、粒子和基团的生成，减少对脂质氧化作用[17]。当激发气体中含有N2和O2时，低温等离子体处理过程中能够生成氮氧基团(ROS和RNS)，其中NOX基团具有较高氧化活性，能够与不饱和脂肪酸发生氧化反应，因此，CO2∶O2∶N2=50%∶10%∶40%包装组鲅鱼肉的TBARS值高于同处理条件的CO2∶O2∶N2=80%∶10%∶10%包装组。类似研究发现增加包装气体中的CO2浓度可以有效地延长牛肉的货架期[18]。

a-处理电压；b-处理时间；c-气体成分；d-阻隔板厚度；组分1：CO2∶O2∶N2=80%∶10%∶10%，组分2：CO2∶O2∶N2=50%∶10%∶40%(下同)图1 不同低温等离子体处理条件对鲅鱼TBARS值的影响Fig.1 Effect of different cold plasma treatment conditions on TBARS value of Spanish mackerel

不同阻隔板厚度对低温等离子体处理后鲅鱼肉中脂质氧化的影响如图1-d所示，随着阻隔板厚度增加，鲅鱼肉的TBARS值呈降低趋势。由于本研究采用的低温等离子体激发系统为双层介质阻挡系统，介质阻隔板厚度直接影响激发电极与处理样品间的距离，因此，阻隔板厚度能够影响低温等离子体的处理效果。当阻隔板厚度从2 mm增加至4 mm时，鲅鱼肉的TBARS值降低了0.403 mg/kg，表明在此范围内阻隔板厚度能够影响低温等离子体对鲅鱼肉的脂质氧化。当阻隔板厚度从4 mm增加至10 mm时，鲅鱼肉中TBARS值降低0.209 mg/kg，表明阻隔板厚度达到一定值后，对低温等离子体的氧化作用无显著影响。本研究中经低温等离子处理后鱼肉的TBARS值均小于5 mg/kg，表明鱼肉仍在可接受范围内。

2.2 不同处理条件对鲅鱼中羰基含量的影响

氧化变性主要通过3个途径：一是其中的赖氨酸和脯氨酸等会氧化生成羰基及其化合物；二是烷氧自由基与烷基过氧化物的酰胺化途径；三是赖氨酸可以与还原糖反应生成羰基衍生物。羰基含量增加与蛋白质氧化程度呈正相关[19]。低温等离子体中的活性成分种类多而复杂，与蛋白质的氧化作用也复杂，为了全面了解低温等离子体对鱼肉中蛋白质成分的作用，分别检测肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的氧化程度。

如图2-a所示，随着处理电压升高，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的羰基含量都显著增加(P<0.05)，二者变化趋势保持一致。当处理电压低于50 kV时， 肌浆蛋白和肌原纤维蛋白中羰基含量随着电压升高而增加缓慢；当电压超过50 kV时，2种蛋白质中羰基含量快速增加。当电压增高至80 kV时，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的羰基含量分别增加至5.215 和4.406 nmol/mg。OLATUNDE等[17]也发现低温等离子体处理亚洲鲈鱼的羰基含量显著高于对照组。经低温等离子体处理后鲅鱼肉中肌浆蛋白与肌原纤维蛋白中羰基含量均随着处理时间的延长而显著(P<0.05)增加(图2-b)。处理5 min后，鲅鱼肉中肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的羰基含量分别增加至5.422和5.069 nmol/mg。羰基的形成与肽骨架断裂及一些活性氧攻击氨基酸侧链有关。低温等离子体处理过程中产生的大量高能粒子以及ROS和RNS可以氧化氨基酸残基侧链，尤其是侧链上有NH—或NH2基团的氨基酸，从而使蛋白质氧化，随着低温等离子体处理时间的延长，ROS与RNS含量上升，从而使蛋白质氧化程度上升[20]。

图2-c所示不同气体成分包装鲅鱼然后经低温等离子体处理后肌浆蛋白和肌原纤维蛋白质的羰基含量变化趋势一致，CO2∶O2∶N2=80%∶10%∶10%包装组羰基含量最低。气调包装组中的O2含量低于空气组，CO2浓度高于空气，在低温等离子体处理过程中降低了含氧基团的生成，从而减弱了对蛋白质的氧化作用。

由图2-d可知，随着阻隔板厚度增加，鲅鱼肌浆蛋白和肌原纤维蛋白中羰基含量逐渐下降。当阻隔板厚度从2 mm增加至8 mm，蛋白质的羰基含量显著下降(P<0.05)；当阻隔板厚度超过8 mm，蛋白的羰基含量基本稳定，表明阻隔板厚度达到一定数值之后对低温等离子体活性成分的影响逐渐减弱。

a-处理电压；b-处理时间；c-气体成分；d-阻隔板厚度图2 不同低温等离子体处理条件对鲅鱼中羰基含量的影响Fig.2 Effect of different cold plasma treatment conditions on carbonyl content in Spanish mackerel

2.3 不同处理条件对鲅鱼中活性巯基含量的影响

巯基含量通常被用作评价蛋白质氧化的另一个重要指标，蛋白质分子中氨基酸基团易被氧化致使巯基含量降低，因此，可以通过测定巯基含量来判断蛋白质的氧化程度。巯基和二硫键是蛋白质中的重要功能基团，巯基含量变化与二硫键的断裂会引起蛋白构象的改变。

由图3-a可知，当电压小于70 kV时，鱼肉肌浆蛋白与肌原纤维蛋白中巯基含量缓慢降低，当电压升高至80 kV时，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的巯基含量分别下降至65.891 nmol/mg和55.114 nmol/mg。这与伏慧慧等[21]报道干腌牛肉中肌浆蛋白与肌原纤维蛋白巯基含量的变化趋势一致。低温等离子体的处理电压越高，对气体的激发能越大，能够激发更多的气体呈现等离子态，形成更多氧化活性的自由基，加剧与蛋白质发生的氧化反应。

由图3-b可知，随着低温等离子体处理时间越长，鲅鱼肉肌浆蛋白和肌原纤维蛋白均呈现显著(P<0.05)下降。处理1 min时肌浆蛋白的巯基减少量最大，之后逐渐下降；肌原纤维蛋白的巯基含量在处理前2 min内下降较快，5 min时下降到79.112 nmol/mg。随着处理时间延长，低温等离子体产生的活性物质诱导蛋白质氧化作用增强，通过巯基分子内或者分子间交联影响二硫键的生成，促使蛋白质结构被破坏而变性。巯基含量随处理时间的延长而下降[22]，与本研究结果一致。

图3-c所示，气调包装组鲅鱼肉肌浆蛋白中活性巯基含量显著(P<0.05)高于空气包装组，肌浆蛋白中活性巯基含量高于相同处理条件下肌原纤维蛋白。当鲅鱼采用80% CO2包装，低温等离子体处理肌浆蛋白中活性巯基含量明显升高。随着阻隔板厚度增加，鲅鱼肌浆蛋白和肌原纤维蛋白中活性巯基含量逐渐上升并趋于稳定(图3-d)。当阻隔板厚度从2 mm增加至4 mm时，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白中活性巯基含量增加显著(P<0.05)，表明在此厚度范围内阻隔板对鱼肉中肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的氧化具有显著影响。当阻隔板从4 mm增加至10 mm时，肌原纤维蛋白与肌浆蛋白变化趋势基本一致，都缓慢增加，表明介质阻隔板厚度超过4 mm对鲅鱼中肌原纤维蛋白和肌浆蛋白中活性巯基含量增加作用减弱。

a-处理电压；b-处理时间；c-气体成分；d-阻隔板厚度图3 不同低温等离子体处理条件对鲅鱼中活性巯基含量的影响Fig.3 Effects of different cold plasma treatment conditions on the active sulfhydryl content in Spanish mackerel

2.4 不同处理条件对鲅鱼中蛋白表面疏水性含量的影响

溴酚蓝和蛋白质变性后暴露出的氨基酸残基的结合量可表示蛋白表面疏水性，蛋白质内部疏水基团暴露程度，与溴酚蓝的结合量和表面疏水性呈正相关[23]。如图4-a所示，当处理电压低于70 kV时，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的表面疏水性二者之间无明显差异。当电压升高至80 kV时，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的表面疏水性显著增加(P<0.05)至12.911和10.552 μg。随着处理电压的增加，蛋白质被氧化致使一些疏水性的脂肪族与芳香族氨基酸侧链集团暴露增加，导致蛋白质解折叠，引起表面疏水性增加[19]。刘娟等[24]发现白斑狗鱼肌浆蛋白与肌原纤维蛋白的表面疏水性也有相似变化。

当处理时间不超过3 min时，鲅鱼肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的表面疏水性无显著差异；当处理时间超过3 min后，2种蛋白的疏水性显著升高(P<0.05)(图4-b)。低温等离子体中活性成分种类较多，由于部分具有氧化活性的粒子半衰期非常短，短时间处理过程中与蛋白质的作用效果有限，诱导蛋白质变性程度低。随着处理时间的延长，有更多活性成分与蛋白质发生作用，破坏更多结构，导致蛋白质内部氨基酸残基暴露量增加，蛋白质变性程度增加。

由图4-c可知，低温等离子体处理气调包装鲅鱼肌浆蛋白与肌原纤维蛋白的表面疏水性降低趋势一致。空气中氧气含量>10%，低温等离子体处理过程中产生的活性氧自由基含量高，促进了鱼肉中蛋白质氧化反应。低温等离子体激发介质成分中O2含量高，能够明显增加脂质和蛋白质氧化程度。这与任思婕等[25]的研究结果一致，O2含量越高，脂质与蛋白质的氧化程度越高。

鲅鱼中肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的表面疏水性随着阻隔板厚度增加而逐渐降低(图4-d)。当阻隔板厚度从2 mm 增加到4 mm时，蛋白表面疏水性显著下降(P<0.05)，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的表面疏水性分别下降了3.607和3.472 μg。当阻隔板厚度从4 mm增加到 10 mm时，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的表面疏水性都缓慢降低。随着阻隔板厚度的增加，低温等离子体对鲅鱼中脂质与蛋白质氧化的影响越来越弱，当超过8 mm后，鲅鱼肉中脂质和蛋白质的氧化程度均没有明显改变。

a-处理电压；b-处理时间；c-气体成分；d-阻隔板厚度图4 不同低温等离子体处理条件对鲅鱼中蛋白表面疏水性含量的影响Fig.4 Effect of different cold plasma treatment on hydrophobicity content of protein surface in Spanish mackerel

低温等离子体处理过程中产生大量的活性粒子，促进了脂质氧化过程中的自由基链式反应，导致脂质氧化，同时，·OH攻击打开的氨基酸侧链或者肽键氧化，生成羰基及羰基衍生物。与羰基含量变化相反，巯基含量会随着氧化程度的加剧而下降，当蛋白质发生氧化，内部的疏水性氨基酸暴露出来，巯基交联形成二硫键，导致巯基含量下降。随着氧化程度越深，蛋白质内部疏水基团暴露增多，蛋白质表面的疏水性越大。

3 结论与讨论

低温等离子体处理在一定程度上增加了鲅鱼样品的TBARS值，即加速了鱼肉中脂质氧化。随着处理电压和时间增加，被处理鱼肉样品中羰基含量明显升高，表明处理后鲅鱼肉蛋白质氧化变性程度增加。延长低温等离子体处理时间、升高处理电压、增加氧气浓度、在一定范围内减少阻隔板厚度均能增加羰基含量和蛋白质表面疏水性，减少巯基含量，促进鲅鱼的蛋白质氧化。低温等离子体处理会加剧鲅鱼中脂质和蛋白质的氧化，因此，应用过程中应严格控制处理条件，将氧化程度控制在可接受范围内。