外泌体microRNA对缺血性脑卒中调控机制的研究进展

苏梓健，詹晨阳，张 婷，韦佩祺，向军军综述，胡跃强审校

缺血性脑卒中(cerebral ischemia,CI)是全球第二大死亡原因，也是导致残疾的主要原因。随着人口老龄化社会的到来，其发病率明显上升，给家庭、社会带来了巨大的精神、物质负担[1]。CI是由动脉粥样硬化、高血压病、血脂异常、糖尿病等多种危险因素引起的[2]。缺血性脑卒中一旦发生可立即导致离子平衡破坏、代谢衰竭和脑细胞中一般蛋白质合成减少，继而诱发梗死灶周围去极化、兴奋性毒性、氧化应激、炎症反应和血脑屏障(blood brain barrier,BBB)破坏，可导致神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和内皮细胞等死亡[3]。近年来的研究发现，外泌体来源的microRNA(miRNA)与CI的发生发展具有密切的关系，脑组织中miRNA的表达、分布和作用，成为早期诊断的分子标志物和有效的治疗靶标，且miRNA能自由通过BBB。miRNA可通过参与细胞凋亡、血管新生、氧化应激抑制、神经炎症及BBB调节等影响CI的发生发展。故本文对外泌体来源miRNA在细胞凋亡、血管新生、氧化应激抑制、神经炎症以及BBB调节方面对CI形成的影响进行综述。

1 外泌体及miRNA的生物学特性

外泌体是一种由晚期内体或多泡体(multivesicular bodies,MVBs)与质膜融合后释放到细胞外环境的小囊泡，系脂质双层球形结构，大小在30～200 nm之间。外泌体内容物包括蛋白质、脂类物质、氨基酸、代谢物、mRNAs和miRNA等，均可反映来源细胞的生物学特点[4]。miRNA是由21～25核苷酸组成的单链非编码小RNA，其主要通过介导靶基因转录本的降解或抑制其翻译，即从转录后水平上抑制相关基因的表达，从而影响生命进程中包括发育、分化、增殖和铁死亡等多种生理病理过程。miRNA广泛分布于动植物基因组中，其表达具有高度保守性、时序性和组织特异性[5]。作为脑卒中治疗的靶点，基于miRNA的策略提供了快速起效。

2 miRNA与细胞凋亡

细胞死亡分为细胞坏死和细胞凋亡，是不可逆的细胞功能的结束。细胞凋亡与CI的发生密切相关，当线粒体功能异常时，可增强促凋亡相关因子表达，继而激活线粒体凋亡通路，是引起急性脑梗死后半暗带区神经元死亡的主要原因[6]。如miR-16系属于miR-15/miR-16簇，已被较好地证明是凋亡相关miRNA。miR-16可在严重肢体缺血和脑卒中患者血清中升高，CI患者的血清miR-15a和miR-16表达水平与对照组相比，可分别升高8.3倍和42倍[7,8]。根据结构和功能，B淋巴细胞瘤2(B cell lymphoma,BCL2)家族蛋白在细胞凋亡中的作用可分为抗凋亡蛋白(BCL-2、BCL-xL和MCL-1等)和促凋亡蛋白(BAK、BAX和BIM等)，通过调节线粒体介导的细胞凋亡参与脑缺血，其中抑制细胞凋亡的主要蛋白是BCL-2。

Yan等[9]实验证明，对小鼠采用大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)造模，与对照组相比，通过上调miR-21的表达可显著降低p53和Bax的mRNA表达和蛋白水平，增加Bcl-2的mRNA表达和蛋白水平，显著改善缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤，表现为每张冠状位脑片梗死面积或总脑梗死体积减少，从而保护大脑免受缺血性损伤。长期的动物实验及临床研究中发现，在数小时内，缺血半影区中的神经元短暂地经历可逆性损伤，并最终发生细胞凋亡，在很大程度上导致I/R损伤中的细胞死亡。作为BCL-2的上游调节因子，磷酸化信号传导与转录活化因子-3(phosphorylation signal transduction and transcription activator-3,p-STAT3)的表达与BCL-2的动态表达一致。在脑缺血再灌注损伤早期，实验研究发现miR-124、信号传导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)与p-STAT3的表达水平在12 h内达到峰值，miR-124的动态表达通过抗凋亡蛋白BCL-2和STAT3有效抑制细胞凋亡，表现出可保护神经元免受脑缺血而发生死亡的作用[10]。这些结果证实了miRNA与细胞凋亡关系紧密，可减轻脑缺血损伤，保护神经元。

3 miRNA与血管新生

血管生成已被证明是导致脑缺血后脑微脉管系统改变的重要事件。局灶性缺血发作后，在啮齿动物和非人类灵长类动物模型中，缺血性核心区域的边界似乎会刺激血管生成。在这些模型系统中，脑缺血发生后4～14 d内可在局部缺血区域观察到新的毛细血管及轴突生长[11]。Zhang等[12]通过小鼠实验证明，将C肽与外泌体结合，并负载胆固醇修饰的miR-210(RGD-exo：miR-210)，将RGD-exo：miR-210静脉靶向注射到脑缺血区域，隔天给药一次，连续给药14 d，发现miR-210、整合素β3、血管内皮生长因子和CD34的表达显著上调，促进脑缺血后脑组织修复的血管生成，小鼠存活率显著提高。内皮细胞是新生脑微血管的主要成分，其功能是血管生成所必需的，包括形态发生、迁移、增殖等。Arderiu等[13]的实验研究发现，脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)促血管生成潜能的调节受miR-145的控制。在ADSCs中，内皮细胞分泌的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)与其受体相互作用，诱导蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)，调节叉头盒转录因子O1(forkhead box O1,FoxO1)转录活性，降低miR-145的表达。敲低miR-145可促进ADSCs分化为内皮细胞，内皮细胞标志物表达增加并诱导毛细血管的形成。另一项研究表明，慢病毒敲低原代小鼠或人脑微血管内皮细胞培养物中的miR-15a/16-1簇可增强氧糖剥夺后的体外血管生成，上调促血管生成蛋白表达。该研究还表明血管内皮靶向敲除miR-15a/16-1簇通过促进血管重塑和刺激功能性血管的生成，促进卒中后血管新生，增加同侧脑血流[14]。而慢病毒过表达miR-15a/16-1簇可抑制体外血管生成，下调促血管生成蛋白表达。

4 miRNA与氧化应激抑制

氧化应激是指体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生与抗氧化防御之间的不平衡，导致ROS蓄积过多而引起机体细胞氧化损伤的过程。氧化应激是脑I/R损伤中最常见、研究最充分的因素，阐明脑I/R损伤氧化应激机制已成为治疗缺血性脑卒中的重要问题[15]。

NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)是许多细胞类型中ROS的主要来源[16]。Zuo等[17]通过MCAO小鼠造模，测定小鼠脑组织或细胞的基因表达水平、ROS产生和凋亡情况，并进行生物信息学分析，NOX2在I/R模型的脑组织和缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型的人神经母细胞瘤细胞(Human neuroblastoma cells,SH-SY5Y)中显著升高，而miR652在脑组织和血浆中的表达显著降低。过表达miR652显著抑制H/R作用下SHSY5Y细胞NOX2的表达和ROS的生成，并降低转染报告基因质粒的细胞相对荧光素酶活性。锰超氧化物歧化酶(manganese-containing superoxide dismutase,MnSOD)和细胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase，EcSOD)具有抗氧化活性，对机体内ROS清除的平衡至关重要，而核因子E2相关因子2(nuclear factor erythtoid 2 related factor 2,Nrf2)是氧化还原敏感的转录因子，可激活超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)表达，从而保护细胞抵抗氧化应激损伤。miR-424表达水平升高降低I/R梗死体积，抑制神经元凋亡，降低皮质ROS和丙二醛水平，增加MnSOD和EcSOD的表达和活化以及氧化还原Nrf2的表达。在神经元培养中，miR-424表达水平升高还可消除H2O2诱导的损伤，表现为降低乳酸脱氢酶漏出和丙二醛水平，提高细胞活力和MnSOD活性；通过Nrf2敲除和SOD抑制剂处理逆转miR-424对氧化应激的保护作用，表明miR-424具有通过抑制氧化应激来预防短暂性脑缺血/再灌注损伤的潜力[18]。

5 miRNA与神经炎症

脑I/R损伤诱导的氧自由基的异常往往在激活氧化应激的同时，还破坏线粒体膜上的钙离子泵并造成谷氨酸诱导的细胞内钙离子的累积，从而导致神经细胞炎症。神经炎症是导致脑I/R损伤发展的主要病理生理因素。

大量研究表明，许多miRNA与CI后神经炎症反应的调控有关。如有学者报道，miR-210在CI患者病灶周围脑白质中的星形胶质细胞较对照神经组织脑白质中的星形胶质细胞表达增加1.6倍。miR-210过表达增加促进星形胶质细胞糖酵解活性，乳酸生成增强，抗炎分子表达增加，同时抑制促炎介质的表达[19]。Zhou等[20]通过蛋白免疫印迹试验结果发现，miR-19a/b-3p抑制剂通过增加沉默信息调节因子1(sirtuin1,SIRT1)水平及降低调节叉头盒转录因子O3(forkhead box O3,FoxO3)、鞘氨醇激酶1 (sphingosine kinases 1,SPHK1)和核转录因子-κβ(nuclear factor kappaB,NF-κβ) p65水平，逆转氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)诱导的蛋白表达变化。同样，miR-19a/b-3p抑制剂可抑制OGD/R损伤后肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β等炎性因子水平的升高，提示通过靶向miR-19a/b-3p/SIRT1/FoxO3/SPHK1抑制炎症反应，可能是改善CI预后的一个有前景的途径。

6 miRNA与BBB调节

中枢神经系统(central nervous system，CNS)的血管具有独特的屏障性质。内皮细胞是构成CNS血管的细胞，通过强的紧密连接、特异性的转运蛋白和有限的内吞作用，共同保护大脑免受毒素的侵害，维持大脑的稳态[21]。卒中后血脑屏障的破坏促进炎症，使白细胞等免疫细胞能够通过血脑屏障迁移并浸润CNS实质。白细胞促进坏死组织的清除和神经元的恢复，但同时也加重BBB损伤，加重CI结局，尤其是再灌注后期[22,23]。

许多差异表达的miRNA已被报道在CI后BBB调节中发挥作用[24,25]。Wang等[26]的研究显示，锌转运蛋白4(Zinc Transporter 4,ZnT4)是miR-30a负调控的直接靶点，下调miR-30a的表达水平，可以降低MCAO小鼠微血管中锌的蓄积，增加ZnT4的表达，阻止紧密连接蛋白的丢失。即使在MCAO后90 min，也能阻止BBB损伤，减少脑梗死体积，改善神经功能缺损。E-选择素(e-selectin,Es)是在炎症过程最初阶段出现的粘附分子，可引起血管细胞粘附分子1(vascular cellular adhesion molecule-1,VCAM-1)表达增加，参与损伤血管内皮细胞，从而加剧脑损伤。观察组与对照组相比，在MCAO小鼠脑组织中miR-126-3p/-5p过表达使VCAM-1和Es表达分别下调3.3倍和3.4倍，显著减少梗死灶，减轻水肿，保护BBB的完整性[27]。还有实验研究发现，miR-98过表达可使MCAO小鼠的血脑屏障通透性降低两倍，3 d后淋巴细胞抗原6复合物高表达(lymphocyte antigen 6 complexhigh,Ly6Chigh)单核细胞减少1.79倍，缺血脑组织内活化小胶质细胞减少两倍，结果提示miR-98过表达可以保护BBB免受促炎Ly6Chigh单核细胞的穿越，从而阻止小胶质细胞的进一步激活[28]。

7 前景与展望

CI发生发展过程复杂，由于BBB的存在，只有少数小分子药物能够通过血流进入脑实质，大分子药物则无法通过BBB，故研究miRNA对其调控机制为CI的防治提供新思路和新靶点具有重要意义。miRNA作为一种可同时调控多种通路及蛋白的非编码RNA，可通过减轻细胞凋亡、抑制氧化应激及炎症反应等方面，从而减轻脑缺血损伤的发生，维持BBB的完整性，促进血管新生，改善神经功能。目前，关于CI的发病机制及治疗的研究较多集中在识别和鉴定与脑卒中相关的miRNA，明确其作用及机制。动物实验研究的重点主要集中于应用miRNA相关抑制剂及模拟物注射小鼠等低级动物。由于患者难以接受侧脑室注射miRNA的给药途径，故临床研究缺乏。随着我们进一步对CI发病机制中miRNA表达和功能的认识的提高，以及对动物实验研究的样本广泛性的增加，进行综合比对分析，后续必将为探索miRNA治疗CI的创新性治疗策略提供潜在的指导和帮助，具有十分广阔的应用前景。