寄主对桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌多样性的影响

丁芷柔 王蕊蕊 周 静 郭春晖 彭 欣 王瀚棠 王 雪 杨振德

（广西大学林学院，广西南宁 530004）

桉树枝瘿姬小蜂（Leptocybeinvasa）隶属膜翅目（Hymenoptera）小蜂总科（Chalcidoidea）姬小蜂科（Eulophidae），是一种外来入侵致瘿性害虫。2000年于中东及地中海地区的赤桉（Eucalyptuscamaldulensis）上首次发现，2007年在我国广西首次被发现，侵入范围现已扩大至海南、广东、江西、云南、四川等地[1]。该虫主要危害分布于热带亚热带的桉属植物[2]，在植物的嫩枝、叶脉、叶柄处形成粒状或索状虫瘿，其中1～2年生的桉树幼林受害严重[3]。

昆虫体内具有丰富的共生微生物，它们对昆虫的生长发育、抗逆性、进化及物种多样性均有重要影响[4]，如为昆虫提供生长发育所需的维生素[5]、增强或降低昆虫对天敌的抗性[6-7]、降低昆虫的繁殖能力[8]等。寄主植物除了影响昆虫代谢、繁殖及防御策略等以外，对昆虫体内共生微生物的丰富度、多样性及功能均有重要影响[9]。如：取食4种不同寄主的柑橘木虱（Diaphorina citri）体内细菌在群落组成和结构中存在差异[10]；取食不同植物的烟粉虱（Bemisia tabaci）内生菌组成存在显著差异，而取食相同植物的烟粉虱内生菌组成较为相似[11]；蟪蛄（Platypleura kaempferi）体内的细菌群落组成与其寄主植物有关[12]；寄主植物影响白背飞虱（Sogatella furcifera）共生菌的感染率[13]。目前，关于桉树枝瘿姬小蜂体内细菌已有一些研究，如王蕊蕊等[14]、Liu等[15]分别对桉树枝瘿姬小蜂体内细菌多样性进行了研究；寇冀蒙等[16]探究了细菌在桉树枝瘿姬小蜂入侵过程中帮助宿主克服桉树次生代谢物的机制；Guo等[17]分析了桉树枝瘿姬小蜂的性别对体内细菌的影响。然而，不同寄主对桉树枝瘿姬小蜂体内细菌组成及多样性的影响如何还未见报道。

对昆虫体内共生菌的研究常以传统培养结合分子生物学的方法进行，既可以提高对分离出的可培养微生物鉴定的准确性，也可以获得一些菌株以便深入研究微生物的功能[18]。本研究使用传统分离鉴定结合16SrDNA鉴定研究寄主分别为巨园桉DH 201-2（Eucalyptus grandis×Eucalyptustereticornis）和窿缘桉（Eucalyptusexserta）的桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌的差异，旨在为阐明桉树枝瘿姬小蜂对不同桉树的适应机制，为利用体内可培养细菌研发桉树枝瘿姬小蜂的生物防控技术提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试虫源采集于广西大学校内教学实验基地隔离种植的巨园桉无性系（DH 201-2）和窿缘桉上刚羽化的桉树枝瘿姬小蜂雌成虫。

1.2 可培养细菌的分离纯化

采集2种寄主上刚羽化的桉树枝瘿姬小蜂成虫各10头，参照王蕊蕊等[19]的方法对虫体进行处理，使用NA培养基分离成虫体内细菌后在28℃和黑暗条件下倒置培养72 h，每隔24 h对细菌生长情况进行观察，记录培养基平板上各种细菌的株数。挑取菌落形态不同的单菌落在NA培养基上纯化培养3次后保存备用，以无菌水涂布培养基为对照。

1.3 可培养细菌的种属鉴定

形态鉴定：将不同单菌落分离出的菌株在NA培养基划线，于28℃下培养72 h，观察记录菌体的形态特征，根据《伯杰细菌鉴定手册》[20]和《常见细菌系统鉴定手册》[21]对菌株进行鉴定。

分子鉴定：按照Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒的方法提取菌株的DNA，参照王蕊蕊等[19]的方法使用细菌16SrDNA通用引物（27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）对DNA模板进行PCR扩增。反应体系30.0 μL (表1)，反应程序：95℃预变性5 min；35个循环包括，94℃变性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸10 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测合格后送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。测序结果在EzBioCloud (http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)上比对供试菌株的16S rDNA序列，并将数据上传至RDP seqmatch和RDP Classifier (https://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp)进行比对，获得各菌株相似度最高的同源序列，用ClustalX进行多序列比对，使用MEGA 5.0的邻位相连法Neighbor-Joining，bootstrap置信度1 000次构建系统发育进化树[22-23]。

表1 PCR反应体系Table 1 PCR reaction system

1.4 可培养细菌群落组成及多样性分析

使用Excel 2013软件进行Margalef指数（D'）、Simpson指数（D）、Shannon-Wiener指数（H'）、Pielou指数（J）及群落组成分析，具体分析公式参照王蕊蕊等[19]的方法。

式中：Ni为细菌i的个体数，N为群落中所有细菌的总个体数，S为细菌种类总数，Pi为细菌i的个体数占全部个体数的比例。

2 结果与分析

2.1 可培养细菌菌体形态、菌落性状及生理生化特征

根据菌体形态、颜色、性状及革兰氏染色等特征共分离鉴定出菌株28株，从寄主DH 201-2获得17株（编号为D1-D17），从寄主窿缘桉获得11株（编号为E1-E11）。其中26株为杆状；6株有芽孢；13株有鞭毛；12株有荚膜；15株菌株呈革兰氏阳性反应，13株呈阴性反应，其余菌株形态特征及培养性状详见表2。

表2 桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌形态特征及培养性状Table 2 Morphology and condition of culturable bacteria in L.invasa

续表 2

对28种供试菌株进行了14种生理生化项目测定，结果显示，所有供试菌株均为糖、醇类发酵型；其中仅D7、D15产生吲哚；仅E6、E9不能产生过氧化氢酶；仅D2、E2、D3、D13能产生色氨酸脱氨酶，在其余检测项目中，不同菌株均表现出显著的差异性（表3）。

表3 桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌的生理生化性状Table 3 Physiological and biochemical characteristics of culturable bacteria in L.invasa

2.2 可培养细菌16Sr DNA序列鉴定

分子鉴定结果表明，从不同寄主的桉树枝瘿姬小蜂成虫体内共分离鉴定4门8纲17属（表4）。其中，分别从寄主为DH 201-2和窿缘桉的桉树枝瘿姬小蜂体内鉴定出4门6纲15属和4门5纲9属，与形态鉴定结果相一致。除寄主DH 201-2的D2、D5、D8菌株分别与寄主窿缘桉的E2、E8、E4菌株高度同源外，其余菌株的同源序列均不相同，这表明不同寄主对桉树枝瘿姬小蜂成虫体内可培养细菌的种类有明显影响。

表4 桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌16Sr DNA 鉴定结果Table 4 The identification of culturable bacteria in L.invasa in the way of 16SrDNA sequence

2.3 可培养细菌系统发育分析

寄主为DH 201-2的桉树枝瘿姬小蜂体内的可培养细菌的系统发育树（图1 a）分为4个类群，第1个类群由变形菌门的泛菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、寡养单胞菌属、根瘤菌属组成；第2个类群由厚壁菌门的芽孢杆菌属、葡萄球菌属组成；第3个类群由放线菌门的壤球菌属、微杆菌属、短小杆菌属、类诺卡氏菌属、微球菌属、短状杆菌属组成；4个类群由拟杆菌门的Dyadobacter属和金黄杆菌属组成，共15属。其中仅D10、D11、D12菌株之间亲缘关系较近同为芽孢杆菌属。

图1 基于16Sr DNA序列寄主分别为DH 201-2（a）和窿缘桉（b）的桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌系统发育进化树Fig.1 Phylogenetic tree of culturable bacteria in L.invasa paratisize DH 201-2(a)and Eucalyptus exserta(b) based on the identification of 16SrDNA sequences

寄主为窿缘桉的桉树枝瘿姬小蜂体内的可培养细菌的系统发育树（图1 b）也分为4个类群，第1个类群由变形菌门的泛菌属、不动杆菌属、寡养单胞菌属、鲍特氏菌属组成；第2个类群由放线菌门的短小杆菌属、微杆菌属和类诺卡氏菌属组成；第3个类群和第4个类群分别由厚壁菌门和拟杆菌门的芽孢杆菌属和类土地杆菌属独自形成两个分支，共9属。其中，E1和E4菌株、E9和E10两对菌株之间亲缘关系较近，分别同属于短小杆菌属和芽孢杆菌属。

虽然两寄主的桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌在门水平上没有差异，均分离鉴定出变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门等4个菌门，但在属水平上有明显差异。可见，不同寄主对桉树种瘿姬小蜂体内菌群的系统发育产生明显影响。

2.4 桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌多样性分析

从寄主为DH 20-2的桉树枝瘿姬小蜂成虫体内共分离鉴定出15个菌属的菌株，其中葡萄球菌属和泛菌属的菌株数量占比（图2 a）最大，分别为24.21%和19.98%，为优势菌属。从寄主为窿缘桉的桉树枝瘿姬小蜂成虫体内分离鉴定出9个菌属的菌株，其中短小杆菌属和泛菌属的菌株数量占比（图2 b）最大，分别为48.95%和27.29%，为优势菌属。不同寄主的共有菌属为泛菌属、不动杆菌属、短小杆菌属、类诺卡氏菌属和微杆菌属，其中泛菌属为二者共有的优势菌属。

图2 寄主分别为DH 201-2（a）和窿缘桉（b）的桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌属水平上的群落组成Fig.2 Community composition at the genera level of culturable bacteria in L.invasa paratisize DH 201-2(a)and Eucalyptus exserta(b)

从表5可知，寄主对桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌的群落结构及多样性有明显影响。寄主为DH 201-2的桉树枝瘿姬小蜂体内菌群群落的D'值、J值、H'值和D值均明显高于寄主为窿缘桉的菌群菌落，说明寄主为DH 201-2的桉树枝瘿姬小蜂成虫体内细菌种类及其多样性较高。

表5 桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌Alpha多样性指数统计Table 5 Alpha diversity index statisticsof culturable bacteria in L.invasa

3 结论与讨论

本研究结果表明，寄主为DH 201-2的桉树枝瘿姬小蜂成虫体内细菌多样性高于寄主为窿缘桉的多样性。Li等[24]研究表明高感品系DH 201-2组织中的单宁含量低于窿缘桉，而氮含量则高于窿缘桉；丽丽等[25]研究发现食物中的单宁会降低生物体内菌群的多样性和丰度，而当施氮含量升高时微生物多样性显著提高[26]。因此，可以推测寄主为DH 201-2的桉树枝瘿姬小蜂成虫体内细菌多样性较高与DH 201-2具有较低的单宁和较高的氮含量有关。

昆虫体内共生菌的种类组成不仅与昆虫种类有关，还受昆虫的寄主或食物的影响。用不同寄主植物或饲料饲喂草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）[27]、美国白蛾（Hyphantriacunea）[28]后其体内优势细菌在属水平明显不同。孟丽雪[10]对寄生在，3种柑橘属上的柑橘木虱（Diaphorina citri）体内细菌研究发现，其优势菌属均为Wolbachia和Escherichia-shigell。本研究结果显示，不同寄主的桉树枝瘿姬小蜂体内细菌菌群结构及多样性存在一定的差异。但是，DH 201-2和窿缘桉均为桉属植物，亲缘关系较近，因此桉树枝瘿姬小蜂体内的菌群组成和优势菌有相似之处。

昆虫体内广泛存在的变形菌门和放线菌门菌群可能对昆虫的生长发育、食物消化、代谢吸收等方面发挥重要作用。寄主为DH 201-2和窿缘桉的桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌的优势菌门均为变形菌门和放线菌门。这与前人在两种果蝇L.boulardi和L.heterotoma[29]、稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocismedinalis）[30]、棉 铃 虫（Helicoverpa armigera）[31]、光肩星天牛（Anoplophoraglabripennis）[32]等其它昆虫上的研究结果相似。

葡萄球菌属是蜚蠊目、鞘翅目和鳞翅目等昆虫体内的优势菌属[33-36]。李冠楠等[37]发现一种葡萄球菌可产多种酶帮助昆虫对营养物质的吸收。此外，葡萄球菌还能通过在昆虫发育初期刺激胰岛素信号通路来对昆虫生长发育产生影响[38]。Wei等[39]发现一种短小杆菌可分泌蛋白酶水解蛋白质，除此之外，在鳞翅目昆虫肠道内的短小杆菌还可以降解天然乳胶帮助昆虫抵御植物防御[40]。本研究发现，葡萄球菌属和短小杆菌属分别是寄主为DH 201-2和窿缘桉的桉树枝瘿姬小蜂体内优势菌属，它们可能与不同寄主条件下营养物质的消化吸收与转化利用有关。一些泛菌属的细菌为桉树、水稻、玉米等植物的致病菌[41]。Dillon等[42]发现一种泛菌属细菌可分泌保护性物质使宿主沙漠蝗（Schistocerca gregaria）抵御胁迫；还有一些泛菌属细菌可通过调控植物免疫防御反应的代谢通路间接保护宿主昆虫在取食过程中不受伤害，如通过调控应答基因JA、SA的表达[43]或调控多酚氧化酶和过氧化物酶的活性[44]。在本研究中，泛菌属为不同寄主的桉树枝瘿姬小蜂体内共有的优势菌属，泛菌属细菌可能在桉树枝瘿姬小蜂克服寄主桉树的化学防御而成功侵入危害桉树的过程中发挥重要作用。

综上所述，寄主植物能显著影响桉树枝瘿姬小蜂体内细菌的种类、群落结构及多样性，这些共生菌是否在桉树枝瘿姬小蜂入侵桉树、抵御胁迫、生长代谢中发挥作用，还有待于进一步研究。