多模式镇痛对坐骨神经慢性收缩损伤大鼠背根神经节的作用及机制*

李斐， 杨晓惠， 迟晓慧， 候俊德， 陈永学， 陈娟**

(1.邯郸市中心医院 麻醉科， 河北 邯郸 056008； 2.邯郸市第一医院 麻醉科， 河北 邯郸 056004)

外周神经性疼痛可能是由于神经损伤或影响体感神经系统外周成分的疾病引起[1]。外周神经细胞体是位于背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)中的小纤维，可释放P物质、降钙素基因相关肽或谷氨酸等神经递质，这些有害的感觉信息从外周组织传递到脊髓[2]。研究表明血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)及其衍生物和醛固酮通过与感觉神经纤维或中枢神经系统表达的受体相互作用，在调节痛觉中发挥作用[3]。AngⅡ是肾素-血管紧张素系统的主要成分，参与控制血压和水液稳态，但也参与其他功能，包括神经系统的其他功能[4]。在药物开发过程中，研究人员发现存在2种血管紧张素受体，包括血管紧张素1型受体(angiotensin type 1 receptor,AT1 receptor)和AT2 receptor[5-7]。研究表明，AngⅡ可以在组织局部产生，参与伤害性传递，并且AT2 receptor拮抗剂具有镇痛特性[8]；AngⅡ可刺激T细胞增殖，增加CD3+T细胞浸润[9]。神经性疼痛作为一种慢性病，可引起痛苦并严重影响患者的生活质量，这种情况常规治疗是难以治愈的[10]。由于外周神经性疼痛的病因、症状和潜在机制的影响，有效药物获批数量少且临床疗效有限，至少45%的神经病理性疼痛患者同时接受2种或多种药物治疗[11]。多模式镇痛是将具有不同药理作用机制的药物联合使用以期望产生更大的疗效，并且更有可能调节多种疼痛机制，旨在通过共同给药以缓解疼痛[12]。多模式镇痛用于坐骨神经阻滞具有诸多优点[13]，但是对坐骨神经慢性收缩损伤(chronic contractile injury of sciatic nerve,CCI)的影响机制尚不明确。因此，本研究探讨多模式镇痛对CCI大鼠DRG的作用和机制，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1大鼠来源 雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(中科院上海实验动物中心)30只，体质量200～225 g；按5只/组饲养于实底聚丙烯笼中，室内温度(22±2)°，空气湿度为(55±15)%，照明控制为12 h光照和1 2h黑暗的循环。大鼠可随意获取饲料和水。

1.1.2主要药物和试剂 曲唑酮和加巴喷丁、0.05% Tween 20、正常山羊血清、牛血清白蛋白、小鼠抗大鼠AngⅡ单克隆抗体(1 ∶200)、小鼠抗大鼠单克隆特异性结合分化簇3(specific binding differentiation cluster 3，CD3)抗体(1 ∶100)、小鼠抗大鼠Alexa Flour 633单克隆抗体(1 ∶500)、小鼠抗大鼠抗生物素蛋白(deglycosylated avidin，Cy3)单克隆抗体(1 ∶800)、蛋白酶抑制剂混合物、小鼠抗大鼠细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，p44/p42 MAPK)单克隆抗体(1 ∶1 000，美国Sigma公司)，戊巴比妥、4%多聚甲醛(上海碧云天公司)，小鼠抗大鼠CD3单克隆抗体(1 ∶100，美国Abcam公司)，Bradford法试剂盒、0.45 μm Immobilon-FL PVDF膜(美国Millipore公司)，小鼠抗大鼠β肌动蛋白单克隆(1 ∶10 000)及IRDye®二抗(1 ∶8 000，美国Invitrogen公司)，HaltTM磷酸酶抑制剂混合物和聚丙烯酰胺凝胶(澳大利亚赛默飞世尔公司)。

1.1.3主要仪器 Randall-Selitto痛觉测试仪(香港友诚生物科技有限公司)，-80 ℃冰箱(日本松下公司)，Axiocam MRm相机(北京荣兴光恒科技有限公司)，Axioskop 40显微镜(上海五久自动化设备有限公司)，Odyssey®CLx 成像系统(美国Li-Cor公司)。

1.2 实验方法

1.2.1实验分组及处理 30只SD大鼠随机均分为对照组(n=10)、模型组(n=10)及多模式镇痛组(n=10)。对照组大鼠行坐骨神经手术假手术处理(坐骨神经暴露但未结扎)，并注射0.9%生理盐水；模型组大鼠行CCI术，3%异氟醚深度麻醉，于右侧髋骨下方切开1个平行于坐骨神经的切口，暴露坐骨神经，将3个结扎线(0～3丝线)松散地绑在坐骨切迹远端的神经周围，间距为1 mm，直到观察到后肢出现短暂抽搐；多模式镇痛组大鼠行CCI术，采用管饲法(曲唑酮)和腹腔注射(加巴喷丁)行多模式镇痛给药处理，其中曲唑酮和加巴喷丁分别溶解于0.9%NaCl。每只大鼠接受皮下苄青霉素60 mg作为抗生素预防；手术当天视为第0天，从术后第1天开始连续给药，1次/d，持续14 d。

1.2.2大鼠挖洞和筑巢试验 手术后第14天给药后1 h，对各组大鼠进行挖洞测试，挖洞性能表示为管中剩余的砾石量；筑巢能力采用5级评分法评估各组大鼠的挖土重量和筑巢能力，分别将床上用品没有明显接触、被褥部分撕裂、垫料大多被撕碎但通常没有可识别的巢穴、可识别但平坦的巢及完美或接近完美的巢定义为1、2、3、4及5分。

1.2.3疼痛阈值 采用Randall-Selitto痛觉测试仪(意大利UGO公司)分别于手术后第3天、第7天和第14天检测各组大鼠的疼痛阈值，以测试针头施加增加的压力(20～500 g/s)，直到大鼠挣扎或尖叫，当大鼠爪子缩回时候的针头压力作为大鼠的疼痛阈值，以克(g)为单位[14]。

1.2.4腰椎DRG制备 取手术后第14天的“1.2.1”项下各组大鼠给药后1 h，采用过量戊巴比妥麻醉处死大鼠，行椎板切除术，取同侧腰椎(L4-L6)DRG，用于后续免疫组织化学(immunohistochemisty,IHC)染色和蛋白质印迹(Western blot)研究。

1.2.5IHC染色检测CD3+T细胞、AngⅡ/AT2 receptor蛋白、NGF及受体表达 取“1.2.4”项下多模式镇痛组大鼠的腰椎DRG切片于IHC染色前风干，含0.05% Tween 20的PBS洗涤2次、10 min/次；切片置于10%正常山羊血清(normal goat serum,NGS)或5%牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)的封闭缓冲液中孵育1～2 h、与一抗孵育20 h、与相应的二抗于室温下孵育1 h；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐染色，ProLong®Gold抗褪色试剂封片；对苯二甲酸丁二醇酯(polybutylene terephthalate,PBST)清洗2次、10 min/次。为鉴定同侧腰椎DRG切片中Ang Ⅱ的细胞定位，使用这些标记物CD3和神经胶质纤维酸性蛋白的同步免疫染色，一抗包括小鼠抗大鼠AngⅡ单克隆抗体(1 ∶200)；小鼠抗大鼠CD3单克隆抗体(1 ∶100)；小鼠抗大鼠CD3单克隆抗体(1 ∶100)；抗体均在含2%NGS或BSA封闭缓冲液的PBST中适当稀释；Axiocam MRm相机的Axioskop 40显微镜于固定曝光时间对切片进行成像。

1.2.6蛋白质印迹分析检测DRG中P-p38 MAPK和P-p44/p42 MAPK蛋白表达 检测时间点为第14天，取“1.2.4”项下各组大鼠的同侧腰椎DRG(L4-L6)于冰上匀浆，放射免疫沉淀(radioimunoprecipitation assay,RIPA)缓冲液提取蛋白质。缓冲液是通过溶解10 mmol Tris 制备，缓冲液还添加了1%HaltTM磷酸酶抑制剂混合物和蛋白酶抑制剂混合物，用 Bradford 方法测定蛋白质浓度；从每个提取物中，总蛋白30 μg加载到4%～20%Mini-PROTEAN®TGX Stain-FreeTM 预制聚丙烯酰胺凝胶上；转移至0.45 μm Immobilon-FL PVDF膜，OdysseyTM 封闭缓冲液中孵育1 h(磷酸化特异性抗体的封闭缓冲液包含 5%BSA和0.1%Tween-20)；将膜与小鼠抗大鼠神经生长因子(nerve growth factor,NGF)单克隆抗体(1 ∶500，H-20)、小鼠抗大鼠酩氨酸激酶受体单克隆抗体(muscarine kinase receptor,TrkA；1 ∶500)、小鼠抗大鼠磷酸-p38 MAPK(phosphoric acid-p38 MAPK,P-p38 MAPK；1 ∶1 000)单克隆抗体、小鼠抗大鼠磷酸-p44/pp42 MAPK(phosphate - p44 / pp42 MAPK,P-p44 / pp42 MAPK；1 ∶1 000)单克隆抗体及小鼠抗大鼠p42/p44 MAPK(phosphate - p42/p44 MAPK,ERK1/2；1 ∶1 000)单克隆抗体，小鼠抗大鼠β肌动蛋白单克隆抗体(1 ∶10 000)为加载对照；PBST洗涤3次、5 min/次，将膜在适当的IRDye®二抗(1 ∶8 000)于室温孵育1 h；Odyssey®CLx 成像系统显示膜。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 挖洞筑巢试验

挖洞筑巢试验结果显示(表1)，模型组大鼠挖土重量和筑巢能力得分分别较对照组和多模式镇痛组降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，多模式镇痛组大鼠挖土重量和筑巢能力得分升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠挖土重量和筑巢能力Tab.1 Digging weight and nesting ability of

2.2 疼痛阈值

疼痛阈值实验结果显示(表2)，多模式镇痛组和模型组大鼠手术后第3天和第7天的疼痛阈值分别较对照组降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；模型组大鼠手术后第14天的疼痛阈值较对照组降低，且多模式镇痛组>模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠的疼痛阈值Tab.2 Pain threshold of rats in each

2.3 DRG中CD3+T细胞的表达

CD3+T细胞检测结果显示，模型组和多模式镇痛组大鼠DGF中表达AngⅡ的CD3+ T细胞和未表达AngⅡCD3+T细胞数量均较对照组增多，且模型组>多模式镇痛组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1和表3。

注：绿色表示CD3+T细胞。图1 各组大鼠DRG中CD3+T细胞的表达(免疫荧光染色，×200)Fig.1 Expression of CD3+T cells in DRG of rats in each group (immunofluorescence staining , ×200)

表3 各组大鼠DRG中CD3+T细胞的定量表达Tab.3 Quantitative analysis of CD3+T cells by immunofluorescence staining

2.4 DRG中NGF及受体的表达

检测结果显示(表4)，模型组和多模式镇痛组大鼠DRG中TrkA蛋白表达分别较对照组降低，且模型组>多模式镇痛组，差异均有统计学意义(P<0.05)；模型组和多模式镇痛组大鼠DRG中前体-NGF蛋白和成熟-NGF蛋白表达分别较对照组降低，且多模式镇痛组>模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组大鼠DRG中NGF及受体的表达Tab.4 Expression of NGF and receptor in DRG of rats in each group

2.5 AngⅡ/AT2 receptor蛋白的表达

检测结果显示，模型组和多模式镇痛组大鼠DRG中AngⅡ和AT2 receptor的蛋白表达较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；多模式镇痛组大鼠DRG中AngⅡ和AT2 receptor 蛋白表达较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5和图2。

图2 各组大鼠DRG中AngⅡ和AT2 receptor蛋白的表达Fig.2 Expression of AngⅡ and AT2 protein in DRG of rats in each group

表5 各组大鼠DRG中AngⅡ和AT2 receptor蛋白的表达Tab.5 Expression of AngⅡ and AT2 receptor protein in DRG of rats in each

2.6 P-p38 MAPK和P-p44/p42 MAPK蛋白的表达

结果显示(表6)，模型组和多模式镇痛组大鼠DRG中P-p38 MAPK和P-p44/p42 MAPK的蛋白表达较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；多模式镇痛组大鼠DRG中P-p38 MAPK和P-p44/p42 MAPK的蛋白表达较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3和表6。

图3 各组大鼠DRG中P-p38 MAPK和P-p44/p42 MAPK蛋白的表达Fig.3 The expression of P-p38 MAPK and P-p44/p42 MAPK protein in DRG of rats in each group

表6 各组大鼠DRG中P-p38 MAPK和P-p44/p42 MAPK蛋白的表达Tab.6 Expression of P-p38 MAPK and P-p44/p42 MAPK protein in DRG of rats in each

3 讨论

在临床环境中，多种镇痛/麻醉技术作为“平衡麻醉”共同给药，以获得更好的麻醉质量并减少术中和术后疼痛[15]。因为疼痛是一个涉及多个致敏过程的动态过程，在不同的手术类型中变化很大，个人对疼痛的敏感性、心理认知差异和个体药理反应都混淆了最终的镇痛效果，即使在研究中组合方案相同，显示出的效果不相同。加巴喷丁是一种抗惊厥药，最初注册用于治疗癫痫，最近被批准用于某些神经性疼痛形式[16-18]。

本研究表明，通过坐骨神经术建立的大鼠外周神经损伤模型中，其同侧腰椎DRG中Ang Ⅱ的表达和CD3+ T细胞的数量增加；通过管饲曲唑酮和腹腔注射加巴喷丁后逆转了Ang Ⅱ和CD3+ T细胞的增加。研究证明，外周免疫细胞(T细胞)会浸润到，在CCI大鼠的腰椎DRG中有大量外周免疫细胞(T细胞)浸润[19-22]。

本研究结果表明，与对照组大鼠相比，多模式镇痛组大鼠腰椎DRG中NGF的前体和成熟亚型的表达水平降低，模型大鼠腰椎DRG中成熟NGF的表达降低可能是由于前NGF的成熟缺陷所致。模型组大鼠腰椎DRG中TrkA蛋白表达上调，TrkA是CCI大鼠腰椎DRG中NGF的高亲和力受体，CCI大鼠中TrkA的表达降低，这表明增强的Ang Ⅱ/AT2 receptor信号与NGF/TrkA通路之间存在潜在的串扰[23-25]，即与单独使用Ang Ⅱ或NGF相比，与NGF共刺激后，Ang Ⅱ诱导的ERK(p44/p42)磷酸化激活降低[26-28]。

本研究还显示，在模型大鼠中P-p38 MAPK和P-p44/p42 MAPK显著增加，这表明将培养的大鼠DRG神经元与Ang Ⅱ孵育30 min可显著增加P-p38 MAPK和P-p44/p42 MAPK的免疫荧光，而多模式镇痛逆转了P-p38 MAPK和P-p44/p42 MAPK的上调；Ang Ⅱ和AT2 receptor不仅由腰椎DRG中的感觉神经元表达，CD3+ T在内的非神经元细胞也能表达。这表明，阻断这些表达Ang Ⅱ以及AT2 receptor的免疫细胞的自分泌和旁分泌激活可减少CCI同侧腰椎DRG中的CD3+ T细胞的浸润[29]。

综上所述，多模式镇痛通过抑制CCI大鼠腰椎DRG中Ang Ⅱ/AT2 receptor信号级联反应及MAPK信号通路的激活，减少了CD3+ T细胞向大鼠腰椎DRG的浸润，从而缓解大鼠外周神经损伤。