EMS对甘啤8号大麦种子萌发期及苗期的影响

柳小宁，包奇军，潘永东，张华瑜，牛小霞，赵 锋

(甘肃省农科院经济作物与啤酒原料研究所，兰州 730070)

大麦是世界上四大禾谷类作物之一，具有生育期短、抗病和耐逆(耐旱、耐盐碱、耐贫瘠)等特点，对气候环境适应性较广[1]，在啤酒酿造，食用，饲用及工业方面具有广泛的用途。近年来，国内产业对区域性特色大麦优质资源的需求不断增加，虽然育种工作者不断进行资源引进，但受环境条件的影响，引进结果难以满足。随着产业发展，地方功能性大麦种质资源急需补充。甘啤系列大麦在广适性、抗病性、品质及产量方面在国内处于领先地位，但在满足特色大麦优质资源的需求方面依然存在差距，因此增加甘啤系列大麦品种的种质资源对发展当地产业(啤酒、养殖、食用等)有重要的意义。甲基磺酸乙酯(EMS)是一种稳定、高效的化学诱变剂，诱变效率高、操作简便，其诱变后获得的突变体，具有后代遗传稳定等多重优点[2-6]，在作物育种研究中已经被广泛应用。高维锡等[7]研究了EMS诱变剂量和处理时间对沙枣幼苗成活率的影响趋势；霍雅馨等[8]研究了EMS诱变技术对箭舌豌豆的影响；许燕等[9]研究了EMS诱变花生珍珠红1号创制优良新种质等。目前，前人已经在拟南芥[10]、水稻[11-12]等模式作物中构建了饱和的突变体库，并利用突变体材料，克隆了大量的功能基因[13-14]，在利用EMS技术助力大麦突变体库的构建、种植资源库及功能基因组学的研究方面，前人也开展了一定的工作。张晓勤等[15]通过EMS诱变当地优良品种，筛选出了理想的后代突变体。秦丹丹等[16]在鄂大麦934的EMS突变体库中筛选出了大麦黄绿叶色突变体。吴博[17]研究指出，不同作物种子对EMS的敏感程度不同，因此要获得EMS诱变产生的后代突变体，首先要选出不同作物种子萌发产生突变的诱变条件。种子萌发期是植物生活史中从种子到幼苗的关键过渡阶段，直接影响植株出苗及生长发育情况[18]。针对不同作物，EMS诱变对种子萌发期和苗期的影响报道也有不少，但是有关EMS诱变甘肃地方大麦品种对萌发期的影响的报道比较少。

本研究利用不同浓度的EMS和不同诱变时间对当地主栽啤酒大麦品种甘啤8号诱变后进行萌发试验，初步筛选出种子在不同诱变时间下的半致死浓度，并对诱变后的种子播种，记录田间苗期性状，通过对种子萌发期指标及苗期性状分析，确定诱变甘啤8号大麦种子的半致死条件[19]。比较啤酒大麦种子经EMS诱变后，大田苗期的表型性状，选出EMS对甘啤8号种子诱变可以产生突变体的最佳条件，为甘啤大麦突变体库的构建奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

啤酒大麦种子甘啤8号，由甘肃省农业科学院经济作物与啤酒原料研究所选育。

诱变试剂EMS，由Sigma公司生产，纯度为99.99%，用0.2 mol/L，pH值7.0磷酸缓冲液按体积(质量)比进行不同浓度配置。

0.2 mol/L,pH 7.0的缓冲液：

储备液A：0.2 mol/L Na2HPO4溶液(53.65 g Na2HPO4·7 H2O或71.7 g Na2HPO4·12 H2O配成1 000 mL)。

储备液B：0.2 mol/L NaH2PO4溶液(27.8 g NaH2PO4·H2O配成1 000 mL)。

以A液61 mL加B液39 mL配置成0.2 mol/L，pH值7.0的缓冲液。

0.1 mol/L Na2S2O3用作EMS诱变失活剂。

1.2 试验设置

参照李颜方等[20]的设计，设置浓度(0.2%,0.3%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%,1.2%)和时间(8 h,12 h,16 h)两种处理，共21个组合，以不加EMS诱变剂为ck。选出经过诱变以后萌发指标达到理论结果的诱变浓度及诱变时间组合；田间苗期性状观察试验，用萌发试验中优选的诱变条件，按照进程对甘啤8号种子提前进行诱变，保证在播种前8 h诱变结束。在同一水肥均匀的地块，以人工开沟撒播的方式播种，每一个处理重复10行，不同处理之间加播2行ck。行长1.5 m，宽0.15 m，行距0.25 m，每行播种100粒，3月15日随大田试验一起播种，管理同大田。

1.3 试验方法

挑取适量干净、均匀成熟的大麦种子按照不同试验设置放入三角瓶，浸种处理，待种子开始萌动时，沥干水分，进行诱变处理。处理温度控制在20 ℃。三角瓶置于通风橱的摇床(50 r/min)上进行诱变处理。

冲洗和风干：诱变完成后，回收所有诱变组合的EMS废液，立即用0.1 mol/L Na2S2O3洗涤3次，使EMS失活，将三角瓶中的种子倒入贴有处理标记的网袋中，流水冲洗1 h，滤纸吸干多余水分，然后放置于通风橱中风干备用。为保证处理效果相同，每批处理的种子数量、EMS水溶液体积、处理温度都相同。

萌发培养：每一个诱变组合均设3个重复，每个重复50粒。次日开始记录每个组合的萌发时间，每天记录种子的萌发数，以芽长到麦粒长度的一半，或者根长度达到整个麦粒长度时视为萌发。每天10:00—11:00时统计萌发种子数量，种子萌发到第7天，在每个重复中随机抽取10株种苗，小心剪下根和芽，测量根长和芽长，并称量根和芽的鲜重。

定期观察各生育期形态性状，记录出苗率。

1.4 萌发指标统计方法

发芽势，发芽率以每天的实际数值为准，刻度尺测量芽长、根长，分析天平称量芽重和根重，结果为实际测量值。田间出苗情况以实际出苗数值为准。

相对发芽率(%)=(每天萌发数量/供试种子萌发数量)×100%；

发芽势(%)=(第3天萌发种子数/供试种子数)×100%；

发芽率(%)=(第5天萌发种子数/供试种子数)×100%；

萌发指数=∑Gt/Dt，Gt为t时间内的萌发数,Dt为相应的萌发天数；

芽长=第7天萌发种子芽长之和(芽基部到芽尖的长度)/萌发的种子个数；

根长=第7天萌发种子根长之和(根基部到根尖的长度)/萌发的种子个数；

芽重=第7天萌发种子的芽重之和/萌发的种子个数；

根重=第7天萌发种子的根长之和/萌发的种子个数；

田间出苗率(%)=(出苗总数/供试种子数)×100%

将观测记录的数据用Excel软件进行统计分析，SPSS分析软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 EMS诱变对甘啤8号种子萌发过程的影响

由图1、图2、图3可以看出，不同时间不同浓度组合诱变后，种子的萌发趋势均表现为逐渐增加到一定时间停止萌发。相同诱变浓度下每天的相对发芽率因诱变时间不同而有差异。除了8 h诱变条件下，诱变浓度0.3%和0.4%的相对发芽率基本同步外，其他诱变浓度之间每天的相对发芽率差异较大。

图1 8 h诱变处理下不同浓度EMS处理的相对萌发率Fig.1 The relative germination rate of different concentrations of EMS treatment under 8 hours mutagenesis

图2 12 h诱变处理下不同浓度EMS处理的相对萌发率Fig.2 The relative germination rate of different concentrations of EMS treatment under 12 hours mutagenesis

图3 16 h诱变处理下不同浓度EMS处理的相对萌发率Fig.3 The relative germination rate of different concentrations of EMS treatment under 16 hours mutagenesis

表1 EMS诱变8 h对萌发指标的影响Table 1 Effects of EMS mutagenesis for 8 hours on germination indicators

从诱变时间对相对发芽率的影响看，不同浓度间8 h诱变相对发芽率均比12 h诱变和16 h诱变处理高。0.2%浓度下，8 h、12 h、16 h诱变第5天的相对发芽率分别是88%、68%、84%。诱变16 h的单日相对发芽率比诱变12 h的高15%～20%；0.3%浓度下，8 h、12 h、16 h等3个诱变时间第5天的相对发芽率分别是84%、62%、64%，16 h诱变处理比12 h诱变处理的相对发芽率高1%～7%；0.4%浓度下，8 h、12 h、16 h等3个诱变时间第5天的相对发芽率分别是84%、44%、59%。第3天开始，16 h和12 h诱变相比，单日相对发芽率高13%～17%；0.6%浓度下，8 h诱变第1天开始萌发，发芽率达到3%，12 h诱变第2天开始萌发，发芽率为1%，16 h诱变第3天开始萌发，发芽率为10%。3个诱变时间第5天的相对发芽率分别是71%、35%、39%；0.8%浓度下，8 h诱变开始萌发时间在第2天，发芽率为6%，12 h和16 h诱变均为第4天，发芽率分别为5%和1%。第5天相对发芽率分别为55%、14%、1%；诱变浓度1.0%和1.2%时，第5天的相对发芽率均未达到40%。可见，甘啤8号种子的诱变浓度应该小于1.0%。

2.2 EMS诱变8 h对甘啤8号种子萌发指标的影响

表1显示，8 h诱变条件下，发芽势随着浓度的升高逐渐降低，诱变浓度0.2%、0.3%、0.4%和ck之间差异不显著(p>0.05)，ck、0.4%、0.6%和0.8%之间差异显著(p<0.05)。诱变浓度为1.2%时，发芽势为0；发芽率随着浓度的增加逐渐降低。诱变浓度0.2%、0.3%、0.4%之间差异不显著，其余诱变浓度之间差异显著(p<0.05)，诱变浓度0.8%时的发芽率达53%；根长随着浓度的增加逐渐降低。ck和0.2%之间、0.3%和0.4%之间及0.8%、0.1%、1.2%之间差异不显著，根长在诱变浓度0.4%、0.6%、0.8%之间差异显著(p<0.05)；从诱变浓度对芽长的影响看，ck、0.2%、0.3%、0.4%之间差异不显著，0.4%、0.6%、0.8%之间差异显著(p<0.05)，相同浓度芽长比根长长1.03～2.78 cm，而且随浓度的增加，芽长和根长之差呈先后降的趋势，诱变浓度在0.6%时差值最大，为2.78 cm；诱变浓度对根重的影响不显著，ck的根重最高；芽重在ck、0.2%、0.3%、0.4%之间差异不显著，其余各浓度之间差异显著；随浓度的升高，萌发指数不断降低，不同浓度处理之间差异显著，诱变浓度0.6%时，萌发指数为54.58%，0.8%时萌发指数为26.31%，说明EMS诱变8 h,浓度0.8%即可对甘啤8号种子产生毒性。

2.3 EMS诱变12 h对甘啤8号种子萌发指标的影响

诱变12 h(表2)，随浓度增加发芽势逐渐降低，诱变浓度大于0.8%，发芽势为0，ck、0.2%、0.4%、0.6%之间差异显著(p<0.05)；发芽率和发芽势相比，诱变浓度0.2%时萌发整齐，诱变浓度达到1.2%时，萌发受到抑制。从显著性看，ck、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%之间差异显著(p<0.05)，0.2%和0.3%之间及0.4%和0.6%之间差异不显著；根长和芽长相比，除了ck，其余各浓度芽长均比根长长，差值在0.54～3.33 cm之间，0.4%诱变浓度下，芽长和根长的差值最大，为3.33 cm；根重只有ck、0.2%、0.3%之间差异显著，其余各浓度差异不显著，ck的根重最高；芽重随浓度增加逐渐降低。芽重在ck和0.2%之间，0.3%和0.4%之间差异不显著，其余浓度之间差异显著(p<0.05)。诱变浓度0.2%时，芽重最高，为0.08 g，比ck高0.01 g；随浓度的升高，萌发指数不断降低，不同的浓度之间差异显著。诱变浓度0.3%时，萌发指数为49.28%，0.4%时萌发指数为32.17%，说明EMS诱变12 h,浓度0.3%即可对甘啤8号种子产生毒性。

表2 EMS诱变12 h对萌发指标的影响Table 2 Effects of EMS mutagenesis for 12 hours on germination indicators

表3 EMS诱变16 h对萌发指标的影响Table 3 Effects of EMS mutagenesis for 16 hours on germination indicators

表4 EMS诱变对苗期的影响Table 4 Effects of EMS mutagenesis on the seedling stage

2.4 EMS诱变16 h对甘啤8号种子萌发指标的影响

诱变16 h(表3)条件下，诱变浓度0.2%、0.3%、0.4%的发芽势比同浓度下12 h诱变高16.00%、8.00%、17.33%，诱变浓度大于0.8%发芽势为零；随诱变浓度增加，发芽率逐渐降低，浓度达到1.0%，萌发受到抑制。0.3%和0.4%之间差异不显著，其余各浓度差异显著(p<0.05)，0.2%、0.3%、0.4%、0.6%诱变浓度下，发芽率比同浓度下诱变12 h高16.00%、3.00%、15.33%、4.00%，诱变浓度大于0.8%时，完全抑制了甘啤8号大麦种子的萌发。诱变浓度0.4%时，大麦种子的发芽率可达到57%；根长随浓度的增加逐渐减低，诱变浓度低于0.8%时差异显著(p<0.05)；芽长随浓度变化的趋势和根长相同，诱变浓度大于1.0%时，EMS完全抑制了甘啤8号种子的生长。从诱变浓度对芽长和根长的影响看，相同的诱变浓度下，芽长大于根长；根重在各诱变浓度下差异不显著，最高值为ck；随浓度增加芽重阶段式降低，0.8%浓度开始芽重为零。0.2%和0.3%之间、0.4%和0.6%之间差异不显著，ck、0.3%、0.4%、0.8%之间差异显著(p<0.05)；萌发指数随诱变浓度的升高不断降低，不同的浓度之间差异显著(p<0.05)。诱变浓度0.3%时，萌发指数为49.85%，0.4%时萌发指数为37.27%，说明EMS 16 h诱变,浓度0.3%即是对甘啤8号种子产生毒性的临界值。

2.5 EMS诱变对田间出苗率的影响

通过室内的EMS诱变甘啤8号种子对萌发指标影响，筛选出0.8%+8 h，0.4%+12 h，0.4%+16 h作为田间诱变播种试验的组合。从田间的出苗率看(表4)，0.8%+8 h组合出苗率达到38%，0.4%+12 h组合出苗率达到66%，0.4%+16 h组合出苗率达到60%；从田间性状看(图4、图5)，除了0.4%+16 h组合出现叶窄，黄条叶，单穗长，花芒的性状，其他两个处理组合与ck相比均没有出现明显的不同性状。

图4 白条叶Fig.4 Ious leaves

图5 花芒Fig.5 Ear

3 讨 论

3.1 EMS诱变对种子萌发期的影响

EMS诱变甘啤8号种子的结果表明，诱变浓度小于0.4%时，8 h、12 h、16 h三个诱变时间段的相对萌发率能达到40%以上，随着诱变浓度增大和诱变时间的延长，种子萌发受到抑制。说明诱变剂浓度越高，对诱变物的抑制作用越大，致使其萌发率降低，这和杜园园等[21]的研究结果一致。诱变12 h和16 h相比，诱变浓度小于0.6%，相应浓度下发芽率呈增加趋势，诱变浓度大于0.6%时，发芽率呈降低趋势，可见低浓度的EMS激发种子的萌发，高浓度抑制种子的萌发，这和刘威等[22]、卢银等[23]的研究结果一致。

在种子萌发指标评价中，发芽势可以较好地反映种子发芽速度和发芽整齐度[24]。研究表明，诱变剂低浓度时，诱变时间不同，浓度间发芽率和发芽势差异均不显著。诱变浓度大于0.4%时，不同诱变时间对甘啤8号种子的萌发影响显著。8 h诱变，诱变浓度大于0.4%，种子的发芽率与其他浓度处理差异显著，诱变浓度达到0.8%时，发芽率达到半致死值(53.33%)，各诱变浓度对甘啤8号种子的萌发均没有完全被抑制；12 h诱变，0.3%和0.4%两个诱变浓度下，发芽率均达到半致死值(42%)，浓度大于1.0%时，发芽率完全被抑制；16 h诱变，诱变浓度为0.4%时发芽率达到半致死值(57.33%)；大于0.8%，发芽完全被抑制。诱变育种研究中通常将萌发期发芽率达到半致死的相应浓度(半致死浓度)作为最佳诱变条件[25-26]，以本试验结果看，EMS诱变甘啤8号发芽率达到半致死浓度的组合为：8 h+0.8%、12 h+0.4%、16 h+0.4%为最佳的诱变条件。陈丽丽等[27]认为，萌发指数是可靠的萌发评价指标，一般情况下，萌发指数大于50%可认为诱变剂对种子基本无毒性。EMS诱变对甘啤8号种子萌发指数影响结果表明，三个EMS诱变时间影响下，EMS对甘啤8号种子产生毒性阈值的诱变条件为0.8%诱变8 h；0.3%诱变12 h；0.3%诱变16 h。

不同诱变时间，诱变浓度对根长和芽长的影响显著(p<0.05)，随着浓度的增加，根长和芽长显著降低，诱变浓度大于0.8%，根和芽的生长均受到抑制，随着诱变浓度增加，抑制作用增强，和藏辉等[28]的研究一致。而根重和芽重相对于ck显著降低，但是不同的诱变浓度之间根重和芽重的差异不显著，和崔霞等[5]的研究结果一致。

3.2 EMS诱变对田间苗期性状的影响

通过室内EMS诱变甘啤8号种子对发芽率及发芽指数的影响，确定了甘啤8号种子的半致死浓度，并在田间进行了播种试验，通过对大田苗期性状的观察分析，诱变8 h+0.8%组合，出苗率达到38%，只表现出有花芒，其他性状均正常；诱变12 h+0.4%组合，出苗率达到66%，其田间性状和8 h+0.8%组合相似；诱变16 h+0.4%组合，出苗率达到60%，田间突变性状明显，表现出叶变窄，黄条叶明显，穗变长，花芒。

4 结 论

分析EMS诱变甘啤8号种子的影响结果，EMS可抑制甘啤8号种子的生长发育。诱变时间和诱变浓度均是影响甘啤8号种子的萌发因素，随着诱变浓度的增大和诱变时间的延长，甘啤8号种子的发芽率和萌发指数逐渐降低。8 h诱变，试验设置的浓度均没有完全抑制甘啤8号种子的萌发，其半致死浓度为0.8%；12 h诱变，其半致死浓度为0.4%，设置浓度达到1.2%时，种子的萌发完全受到抑制；16 h诱变，其半致死浓度为0.4%，设置浓度达到0.8%时，甘啤8号种子的萌发完全受到抑制；根长和芽长逐渐降低，对EMS的响应程度为芽长>根长，各诱变浓度间根重和芽重的差异不显著。

从田间性状看，16 h诱变，0.4% EMS可作为甘啤8号种子最佳诱变条件。