气相色谱-质谱联用法检验乙蒜素

李 婧，何贵琴，褚莹莹，刘艳艳

(1. 安徽省公安厅物证鉴定中心，合肥 230061；2.蚌埠市公安司法鉴定中心，安徽 蚌埠 233000；3.安徽大禹仪器有限公司，合肥 230061)

乙蒜素（Ethylicin）是一种广谱性杀菌剂，分子式为C4H10O2S2，分子量为154.251，CAS号为682-91-7。乙蒜素纯品为微黄色或无色油状液体，沸点为56 ℃，140 ℃易分解，在酸性溶液中稳定，但在碱性条件下不稳定，可溶于乙醚、氯仿、乙醇和苯等多种有机溶剂，有较强的腐蚀性，强挥发性，具有醋酸和大蒜臭味[1]。乙蒜素结构式见图1，为我国首创农药新品种，价格低，按照我国农药毒性分级标准，属于中等毒性，国内中毒致死案例少见[2-3]。目前，国内对乙蒜素常用检测方法为气相色谱/氢火焰离子化检测器（GC/FID）[4]，气相色谱/电子捕获检测器（GC/ECD）[5]和高效液相色谱（HPLC） 法[6]，由于其在140℃时易分解，所以国内乙蒜素的GC-MS法相关报道很少，且质谱定性时均缺少乙蒜素的关键特征离子碎片154[7-8]。本文利用GC-MS法对乙蒜素进行检测研究，填补了国内这方面检验的空白，并对乙蒜素农药中毒案件中相关检材进行检测，为案件侦查和定性提供技术支撑。

图1 乙蒜素结构式Fig.1 The structure of ethylicin

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

气相色谱-质谱联用仪GC-MS-QP 2010 plus（日本岛津公司）。

乙蒜素标准品（98.4%，国家农药产品质量监督检验中心）；二氯甲烷、氯仿、环己烷（均为分析纯，汕头市西陇化工厂有限公司）；乙醇（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸氢二钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；柠檬酸（分析纯，烟台市双双化工有限公司）。

1.2 分析条件

仪 器 条 件：RTX-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细柱；柱温：初始温度50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至160 ℃，保持3 min；载气：高纯He，流速：1 mL/min，分流比：2∶1；进样口温度：140 ℃，传输线温度：140 ℃，离子源温度：200 ℃；电子轰击离子源：70 eV，扫描方式：SCAN，质量采集范围：m/z45～200 amu，溶剂延迟：3 min。

1.3 标准溶液的配制

精确移取乙蒜素标准品适量，用乙醇配制成浓度为1.0 mg/mL的标准物质储备液，密封，置于冰箱中冷冻保存备用，乙蒜素标准物质工作液由储备液配制得到。

1.4 样品前处理

1.4.1 样品前处理

取胃内容物2.0 g，匀浆化，加入0.5 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（pH=3.0），加入二氯甲烷6.0 mL，涡旋振荡5 min，高速（8 000 r/min）离心10 min，提取有机相，重复提取一次，合并两次提取的有机相于尖底试管中，氮气吹至近干，加入0.1 mL乙醇定容，供GC-MS分析。

1.4.2 空白胃内容物添加样品前处理

取空白胃内容物2.0 g（6份），分别添加一定量乙蒜素标准溶液，涡旋振荡混合后，按照1.4.1进行操作。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的选择

2.1.1 提取溶液的pH值的选择

本文考察了pH分别为3.0、5.0和7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液对乙蒜素的提取效果，实验结果显示，pH为3.0和5.0时，目标物的提取效果基本一样，但明显高于pH为7.0条件下的提取效果。这与乙蒜素的化学性质有关，乙蒜素在酸性溶液中稳定，但在碱性条件下不稳定。后续实验采取的是在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（pH=3.0）体系下进行提取。

2.1.2 液液提取溶剂的选择

本文考察了二氯甲烷、三氯甲烷和环己烷四种溶剂作为提取溶剂的提取效果。实验结果表明：二氯甲烷作为提取溶剂得到的乙蒜素的总离子图中峰面积最大，提取效果是二氯甲烷＞三氯甲烷＞环己烷，二氯甲烷提取效果最好，故后续实验都采用二氯甲烷作为提取溶剂进行前处理。

2.2 GC-MS定性分析方法的优化确立

2.2.1 仪器进样口、传输线温度和离子源温度的优化

本文考察了浓度分别为0.005、0.05、0.5、5.0和50.0 μg/mL的乙蒜素标准工作液在不同进样口温度、传输线温度和离子源温度条件下进样出峰情况，结果见表1。

由实验结果可以看出乙蒜素在表1序号1条件设置下，除0.005 μg/mL以外其余浓度乙蒜素均能检出，能够满足实验的要求。因为乙蒜素在140 ℃易分解，所以仪器各部分温度对乙蒜素检测影响比较大，所以设置进样口温度为140 ℃，传输线温度为140 ℃，离子源温度为200 ℃。

表1 乙蒜素在不同进样口温度、传输线温度和离子源温度条件下进样出峰情况Table 1 Ethylicin determined under different temperatures at inlet, transmission line and ion source

2.2.2 升温速率的选择

本文考察了三种升温速率对同一浓度下乙蒜素的分析效率和其他杂质的分离效果：

1）初始温度50 ℃，保持1 min，10 ℃/min，升至160 ℃，保持3 min。

2）初始温度50 ℃，保持1 min，5 ℃/min，升至160 ℃，保持3 min。

3）初始温度50 ℃，保持1 min，20 ℃/min，升至280 ℃，保持3 min。

实验结果表明：在第一种程序升温下对乙蒜素进行分离定性检测，乙蒜素的保留时间为9.730 min，乙蒜素出峰效果很好，而且和基质有很好的分离度。浓度为5 μg/mL的乙蒜素标准溶液GC-MS分析的总离子流图见图2a。将5 μg/mL乙蒜素标准工作液根据优化后的条件取样1 μL进行检验分析，乙蒜素的保留时间为9.730 min，特征离子碎片为154、95、77、61。所得质谱图如图2b。

图2 浓度为5μg/mL的乙蒜素GC-MS分析总离子流图（a）和质谱图（b）Fig.2 Total ion-current chromatogram and mass spectrogram (EI) from GC-MS (5μg/mL ethylicin)

2.3 方法的标准曲线、检出限、回收率和相对标准偏差

在空白胃内容物中依次加入适量乙蒜素标准溶液，使得乙蒜素浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/g，按照1.4.1步骤进行操作，进样分析。乙蒜素出峰良好。以乙蒜素的峰面积（y）为纵坐标，以乙蒜素标准样品浓度（x，μg/g）为横坐标作线性回归。从表2可知，本方法对乙蒜素有良好的线性关系，采用在空白胃内容物中添加目标化合物的方法，依3倍信噪比确定检出限。

表2 GC-MS分析乙蒜素的线性方程、R2和检出限Table 2 The linear equation, correlation coeff icient and LOD

使用在空白胃内容中添加乙蒜素的方法测定加标回收率，评价方法的可靠性。添加乙蒜素0.5、5.0、20.0 μg/g 3个浓度，每个浓度分别取5份样品进行平行实验，按照1.4.1方法进行测定，结果见表3。

表3 空白胃内容物中乙蒜素的回收率和相对标准偏差(n=5)Table 3 Recoveries and RSDs of ethylicin in the gastric contents (n=5)

3 案例应用

笔者于2021年10月受理一件案件，一名女性头部被其丈夫用石头砸伤，接着喝乙蒜素农药未被及时抢救最终死亡。办案单位送来了农药瓶、呕吐物、胃内容物和血液等相关检材，笔者按照本方法对检材进行处理后，在农药瓶、胃内容物和呕吐物样本中均检出乙蒜素成分，但是在血中未检出乙蒜素成分。配制乙蒜素系列浓度的空白血添加样品进样分析，经1.4.1步骤操作，按照1.2分析条件检测，在所有添加乙蒜素的空白血样品中均未检测出乙蒜素成分。

国内服用乙蒜素自杀的案例虽有报道，但均是医生对乙蒜素中毒抢救与救治体会的相关报道，乙蒜素在人体内的药物代谢动力学和理化检验在国内外均无相关报道，可参考资料有限。经查阅大量资料，Freema等[9]对大蒜素在血液、有机溶剂和模拟生物体液中的稳定性研究一文中，发现大蒜素加入到血液中极不稳定，立即损失83%，5 min后完全消失，这可能是大蒜素和血红蛋白的二价铁快速反应引起的。由于乙蒜素与大蒜素结构相似，是大蒜素的乙基同系物，由此推断乙蒜素可能与血红蛋白的二价铁也会快速反应消失，造成血中检不出乙蒜素成分。

4 结论

本实验建立了胃内容物中乙蒜素检测的GC-MS方法，填补了国内乙蒜素GC-MS检测方法的空白。本方法简便快捷，干扰少，且回收率高，重现性好，灵敏度高，可满足此类涉毒案件定性的需要，给类似案件的实验室检验提供GC-MS方法参考。同时对血中乙蒜素以及空白血中添加乙蒜素做了大量实验研究，为血中乙蒜素的检验鉴定工作提供经验与参考，为刑事案件的定性提供有力支撑。