硒营养强化对赣南脐橙果实硒组分及品质的影响

张永浩，姚锋先，杨忠兰，陈 蓉，温 莉，刘桂东，赖金平，周高峰，管 冠，庄 霞

(赣南师范大学 国家脐橙工程技术研究中心/生命科学学院，江西赣州，341000)

硒(Se)是维持人体健康所必需的微量元素，具有抗氧化、提高免疫力和预防癌症等功能[1]，但中国约有51%的国土缺Se，39%～61%的中国居民每天Se摄入量约26～34 μg，低于世界卫生组织/粮农组织推荐的Se摄入最低标准(40 μg/d)[2-4]。目前，通过外源补硒获得富硒农产品是缺硒地区补硒的最佳选择[5]。硒强化措施不仅能提高植物硒含量，还能提高品质。但目前硒生物强化植物主要集中在水稻[6]、小麦[7]和玉米[8]等大田作物，在果树上的研究较少。赣南是全国最著名的富硒地区之一，也是中国第一大纽荷尔脐橙产区[9]，但脐橙果实中硒浓度未能达到江西省富硒水果标准(10 μg/kg)，探究如何生产富硒、高品质脐橙具有现实意义。

目前，硒强化主要通过土壤施用和叶面喷施两种方式。相对于土壤施用，叶面喷施硒肥不仅减少土壤污染和固化，而且吸收效率高[10]，因此是比较常用的喷硒方式。作物对外源硒的吸收和转化也会受到施硒浓度、施硒时期和作物生长阶段等因素的影响[11]。已有研究表明，作物生长后期施硒较生长早期对硒的吸收效果好[12]。在苹果开花期和幼果期喷施硒肥，果实中主要为有机硒，而在着色期喷施则会导致无机硒含量显著增加，且喷施不同浓度和次数的硒肥也会影响苹果叶片和果实中无机硒和有机硒比例[13]。在虹鳟(Oncorhynchusmykiss)上的研究表明，有机硒摄入相对于无机硒的有效性更高[14]。目前，有关提高脐橙果实中有机硒含量的最佳施硒时期和浓度的报道较少。

硒处理对作物的影响因施硒浓度和时期而异。叶面喷施适量硒肥能提高沙棘果实的维生素C和总黄酮含量，但高浓度硒处理降低总黄酮含量[15]。叶面喷施150 mg/L的亚硒酸钠较其他处理浓度能显著提高甜柿果实的可溶性固形物、可溶性糖以及维生素C含量[16]。在“本地早”柑桔幼果期、膨大期和着色期分别喷施200 mg/L的亚硒酸钠，结果表明在幼果期喷施能显著提高果实品质[17]。柑桔中含有的总黄酮、总酚、维生素C不仅是衡量果实品质的指标，也是对人体十分有益的抗氧化物质[18]，而外源硒处理能影响植物体内抗氧化物质的含量。外源喷硒处理，能提高茶叶的维生素C、酚类和脯氨酸含量[19]。硒处理显著提高小麦幼苗的花青素、黄酮和酚类化合物含量[20]。目前关于硒营养强化影响脐橙果实品质的报道较少。柑桔果实风味主要是由糖含量以及糖组分差异所决定的[21]，而外源硒处理能影响植物体内糖代谢[22]。硒处理提高了小麦籽粒的可溶性总糖和蔗糖含量[23]。喷施亚硒酸钠后，在常温条件下导致生菜的蔗糖含量显著下降以及葡萄糖含量积累；高温条件下会导致前期积累蔗糖含量，而后期无显著性影响，并减少葡萄糖含量积累[24]。可见，不同植物糖代谢对外源硒的响应不同。

本研究以亚硒酸钠为叶面肥，在不同时期对脐橙进行喷施，探究外源硒肥对脐橙果实硒含量、品质和可溶性糖含量的影响，以期明确纽荷尔脐橙果树叶面喷施亚硒酸钠的最佳时期，为赣南脐橙优质富硒栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2021年在江西省赣州市信丰县安西镇信丰华橙果业有限公司果园，选取树体长势基本一致的4年生枳(Poncirustrifoliata)砧纽荷尔脐橙(Citrussinensis‘Newhall’)为材料。供试硒源为亚硒酸钠(Na2SeO3)。

1.2 试验设计

叶面喷施硒肥浓度为200 mg/L(以亚硒酸钠计)。在第二次生理落果后的幼果期(6月16日)喷施1次为处理1(T1)，在果实膨大期(7月13日)喷施1次为处理2(T2)，在幼果期(6月16日)和果实膨大期(7月13日)各喷施1次为处理3(T3)，对照组(CK)不做处理，共4个处理。每个处理共有4株树体长势基本一致的果树。喷施程度以叶面均匀产生水滴并不滴落为标准，每株2 L。

1.3 样品采集与制备

在果实成熟期(11月20日)进行采样。选择树冠外围中部区域，在东、南、西、北四个相同方位各采集1个健康无病虫害的果实，放入预冷的冰盒中带回实验室。每株果树的4个果实，每个果实取1/4果肉混合样榨汁测定可溶性固形物、可滴定酸、维生素C含量，剩余果汁液氮速冻后放入-80 ℃保存用于测定总黄酮以及总酚含量，另1/4果肉混合样液氮速冻后放入-80 ℃保存测定可溶性糖含量以及硒元素。

1.4 样品测定

1.4.1 硒含量测定 总硒含量测定：称取3.000 g(精准到0.001 g)果肉，加入10 mL HNO3后静置过夜，在电热板上160 ℃加热浓缩至2 mL，取下冷却，加入3 mL HCl消解至1 mL，冷却加入2 mL HCl，用蒸馏水定容至25 mL，过滤，得待测液。用氢化物-原子荧光光谱法(HG-AFS 9120，北京吉天)测定总硒浓度，用小麦粒标准物品(GBW-10011，GSB-2，中国)进行质量控制，要求总硒回收率为91.4%～97.0%(GB 5009.93—2017《食品安全国家标准食品中硒的测定》)。

硒形态测定：采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法(HPLC-ICP-MS)对脐橙果肉中的硒形态进行检测，包括硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒酸盐(SeO42-)以及亚硒酸盐(SeO32-)含量。试验过程中设置标准物质进行质量控制，要求硒代蛋氨酸富硒酵母标准物质的回收率在83.1%～101.5%之间[25]。硒有机化比例(%)=(有机硒含量/总硒含量)×100%。

1.4.2 果实品质测定 可溶性固形物采用便携式折光率仪测定(PAL-1，ATAGO)。可滴定酸采用氢氧化钠中和滴定法测定。维生素C采用2，6-二氯酚靛酚法测定[26]。固酸比=可溶性固形物含量/可滴定酸含量。

总黄酮含量采用亚硝酸钠-氯化铝法[27]测定，槲皮素为标准物。榨取果汁放入-80 ℃保存，测定时快速解冻，在冷冻离心机4 ℃、10 000 转/ min条件下离心5 min，取0.5 mL上清液，加入0.5 mL质量分数 5% NaNO2，轻轻摇匀，静置5 min，再加入0.5 mL质量分数 10% AlCl3，轻轻摇匀，静置6 min，加入5 mL 1 mol/L NaOH，最后用蒸馏水定容至10 mL，静置30 min后，在紫外分光光度计415 nm下测定吸光值。

总酚含量以福林酚法测定[28]，没食子酸为标准物。取0.1 mL上清液，加入0.5 mL福林酚，摇匀，1 min后加入1.5 mL 1 mol/L Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至10 mL，充分摇匀，室温放置2 h后，在紫外分光光度计760 nm下测定吸光值。

1.4.3 可溶性糖含量测定 可溶性糖提取：称取1.000 g(精准到0.001 g)果肉，充分研磨后倒入玻璃试管中，加入4 mL体积分数为80%的酒精，80 ℃震荡水浴30 min，冷却，7 000 转/min离心10 min，取上清液，剩余残渣再重复提取。向上清液中加入10 mg活性碳，80 ℃水浴褪色30 min，蒸馏水定容至10 mL，过滤活性碳，得待测液[29]。

可溶性糖分测定：可溶性总糖采用硫酸-乙酸乙酯法[26]测定。蔗糖和果糖采用间苯二酚法测定[29]。还原性糖采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定[30]，取稀释10倍的待测液1 mL，加入1 mL蒸馏水，再加入4 mL DNS试剂，87 ℃水浴反应5 min，最后在紫外分光光度计540 nm测定其吸光值。葡萄糖含量为还原性糖含量减去果糖含量。糖酸比=可溶性总糖含量/可滴定酸含量。

1.5 数据分析

每个处理4个生物学重复，3个技术重复。使用SPSS 21.0进行方差分析，采用Duncan’s法进行显著性检验(α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 硒含量和形态

试验结果看出，硒处理显著增加脐橙果实的硒含量。其中，T3处理的总硒含量(18.4 μg/kg)最高，较CK(空白处理)提高9.2倍，较T1和T2处理分别提高124.4%和7.6%，说明果实总硒含量随着喷硒总次数的增加而提高。T2处理总硒含量较T1处理提高108.5%，说明喷施时期从幼果期后移至果实膨大期，硒吸收效率提高。脐橙果实中的硒主要以有机硒形态存在，硒有机化比例为81.27%～100%，硒处理果实硒有机化比例较CK提高了19.9～23.0个百分点。所有处理的有机态硒均以硒代胱氨酸(SeCys2)形式存在，未检出其他形态的有机硒；所有处理的无机态硒均以亚硒酸根离子(SeO32-)的形态存在。T2处理(膨大期喷施)提高了果实无机硒含量(见表1)。

表1 不同硒处理脐橙果实的硒含量和形态

2.2 果实品质

试验结果看出，硒营养强化对脐橙果实品质有一定影响。与CK比较，硒处理果实可溶性固形物提高了9.8%～20.3%。T3处理的可溶性总糖含量(11.5%)较CK提高了16.2%，固酸比(21.4)较CK提高了19.6%。T1和T2处理的总酚含量均较CK降低。整体上，叶面硒处理能提高脐橙果实品质，其中T3处理的效果最好(见表2)。

表2 不同硒处理脐橙果实的品质

2.3 可溶性糖

不同硒处理的脐橙果实还原性糖含量差异无显著性。T3处理的葡萄糖含量(26.8 mg/g)较CK提高了13.6%，T1和T2处理的葡萄糖含量与CK相比无显著性变化。不同硒处理果实的果糖含量差异无显著性。T1和T3处理的蔗糖含量分别为59.2和66.5 mg/g，较CK分别提高了12.8%和26.7%。整体而言，叶面硒处理对果实可溶性糖组分中的蔗糖和葡萄糖含量产生影响，尤其对蔗糖含量的影响最大。其中，T3处理的蔗糖和葡萄糖含量升高最明显(见表3)。

表3 不同硒处理方式脐橙果实的可溶性糖含量 mg/g

3 讨论与结论

适宜的硒处理能提高果实品质。本试验在脐橙果实膨大期喷施1次或者在幼果期和膨大期各喷施1次200 mg/L亚硒酸钠，使脐橙果实达到了富硒水果标准，且2次喷施的效果更好。在植物不同生长时期喷施硒肥，植物对硒的吸收效率不同。本试验中，果实膨大期喷施硒处理的果实总硒含量较幼果期喷施硒处理高108.5%，幼果期和膨大期均喷施硒处理果实总硒含量又比膨大期喷施一次处理高7.6%。说明，喷硒的时期会影响脐橙对硒的吸收和积累，果实膨大期喷硒脐橙对硒的吸收效率较高；在幼果期和膨大期两次喷硒后对硒的吸收积累以及果实品质的影响进一步提升，但树体及果肉中硒含量达到一定浓度后，植物对硒的吸收积累会变弱，即植物对硒的吸收积累与硒肥用量并非线性关系。这与在马铃薯[31]和杧果[32]上研究的相关研究结果类似。分析认为，这可能是延迟硒的喷施时期能促进硒从叶流向茎中的运输，进而提高果肉中硒含量[33]，同时，脐橙果实对硒的吸收具有一定的范围值。邓小芳等[34]研究表明，猕猴桃叶面喷施硒肥，幼果期喷施处理果肉硒含量较膨大期喷施处理更高。可见，喷施时期对作物吸收硒效率的响应与物种有关。

食用有机硒相比无机硒更符合食品安全。通过外源无机硒强化，使无机硒在植物可食用部分中转化为有机硒，可满足人们日常膳食补硒的要求。本试验中，外源硒处理提高了脐橙果肉总硒含量和有机硒占比，其中有机硒占比为97.4%～100.0%，且有机硒以硒代胱氨酸(SeCys2)的形式存在于果肉中。这与宁婵娟等[13]的研究结果类似一致，即红富士苹果在5、6和7月中旬共喷施3次100 mg/L亚硒酸钠效果最佳，果实有机硒转化率高达87.7%。但也有研究发现，梨叶面喷施硒肥，梨果汁中有机硒转化效率低于8.0%[33]。这可能是由于不同植物对有机硒的转化效率不同，也可能与硒肥的喷施时期和浓度有关。本试验中脐橙果肉中的无机硒均以亚硒酸根离子(SeO32-)形态存在。这可能是因为试验地点为南方酸性土壤，而酸性土壤中主要为亚硒酸盐。

已有大量的研究报道，适当的硒处理能提高植物光合作用，从而影响植物可食部分的品质。Zhu等[35]研究发现，叶面喷硒处理的葡萄果实可溶性总糖、硒含量和叶片净光合速率均高于对照。在果树上施用硒肥有利于提高果实可溶性固形物、可溶性糖和维生素C含量，降低可滴定酸含量[36-37]。在本研究中，叶面喷硒处理提高了脐橙果实中可溶性固形物含量、可溶性总糖含量和固酸比，同时不同硒肥处理时期和次数对脐橙果实品质的影响不同。这表明脐橙果实品质受硒肥喷施时期和次数的共同调控。本研究中，除T3处理外，T1和T2处理果汁中总酚含量较CK低。Rao等[38]研究表明，0.1 mmol/L硒酸盐处理提高了西兰花中总黄酮含量，但0.4 mmol/L硒酸盐处理降低了西兰花中的总黄酮含量。由此认为，本试验中硒处理浓度过高，可能使酚类代谢物质含量下降。

蔗糖是一种包括柑桔在内的大多数植物叶片中输出的光合同化物，成熟叶片中大部分蔗糖(源)通过韧皮部输出到器官(库)中，这些器官是光合同化物的净消耗物[39]。蔗糖、果糖和葡萄糖是柑桔果实中主要的可溶性糖。在本研究中，T1和T3处理的蔗糖含量较CK分别提高了12.8%和26.7%，T3处理的葡萄糖含量较CK提高了13.6%，但整体上硒处理后果糖和还原性糖相比CK无显著性变化。Lara等[23]的研究结果(与对照相比较，外源硒处理能提高小麦可溶性总糖和蔗糖含量)，与本试验结果一致。陈建伟[40]研究表明，叶面喷施亚硒酸钠有利于提高苹果果实成熟后期蔗糖合酶、蔗糖磷酸合酶的活性，促使蔗糖合成代谢，增加蔗糖的积累。由此认为，硒处理能提高脐橙果实蔗糖含量，可能是与硒处理影响了蔗糖代谢相关酶活性有关。但糖代谢的过程受多种因素的影响，更深层的调控机制需要进一步研究。

综上所述，适当的叶面硒处理可以提高脐橙果实中的有机硒含量，使果实达到富硒水果标准；同时，硒处理可以提高脐橙果实的可溶性固形物、可溶性总糖和固酸比等，对果实品质的提升有积极作用。基于本试验结果，建议的外源硒强化方式为在赣南脐橙幼果期和膨大期各叶面喷施一次200 mg/L亚硒酸钠。