上皮间质转化与乳腺癌干细胞的关系

吴婷月， 陈雯敏， 陈策实

(1.中国科学技术大学 生命科学与医学部， 安徽 合肥 230026； 2.中国科学院昆明动物研究所 云南省动物模型与人类疾病机理重点实验室， 云南 昆明 650221； 3.中国科学院大学 存济医学院， 北京 100049； 4.昆明医科大学 生物医学工程研究院， 云南 昆明 650504； 5.云南省肿瘤医院， 云南 昆明 650118)

专家简介：陈策实，昆明医科大学研究员，中国科学院昆明动物研究所客座研究员，博导。获得中国自然科学基金委“杰出青年”基金，国家科技创新领军人才和云南省云岭学者称号，荣获云南省和重庆市科技进步一等奖。主持国家自然科学基金重点项目，科技部重点研发计划项目首席科学家。长期从事乳腺癌、泛素化、干细胞、动物模型和抗癌药物等方面研究，发表SCI论文130余篇，获得发明专利3项，被引用7 000多次。任InternationalJournalofBiologicalSciences执行主编，CancerScience副主编。担任中国抗癌协会乳腺癌专业委员会常委和中国细胞生物学会理事。

乳腺癌是发生在乳腺上皮的一种恶性肿瘤，是女性中最常见的肿瘤。目前乳腺癌的治疗策略包括了手术、化疗、放疗、内分泌治疗、靶向治疗及免疫治疗等。然而，许多晚期患者仍然面对肿瘤转移、疾病复发以及耐药，最终导致死亡，这是因为部分乳腺癌细胞可以获得肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)特性，从而增强其抗化疗或放疗的能力，放化疗后乳腺癌干细胞(breast cancer stem cell, BCSC)在肿瘤中比例的上调，进一步增加了肿瘤的异质性，从而导致治疗失败或者肿瘤复发转移[1]。肿瘤细胞的异质性给癌症治疗提出了巨大的挑战。

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞获得间充质表型的过程，允许上皮细胞脱离原发肿瘤部位并向远处转移。在乳腺癌中，这2个过程也是紧密相连的，大量研究显示经历EMT的细胞具有干细胞特性，具有干性的肿瘤细胞也表达EMT标记[2]。最近，EMT被发现是一种动态的、混合的上皮和间充质状态，这种状态下上皮和间充质是共存的，与癌症进展和干细胞特性密切相关[3]。这些研究提示EMT信号参与了BCSCs的形成和维持。

乳腺癌细胞同时受益于这2种特性提供的优势，并表现出更高的转移能力和抵抗不同治疗方式的能力。然而，关于EMT和BCSCs的关系到底如何？为什么EMT会增加乳腺癌细胞的干性？EMT发生为什么会导致乳腺肿瘤复发、转移及耐药？EMT的可逆过程间质上皮转化(mesenchymal-epithelial transition，MET)和BCSCs又是什么关系？如何通过靶向EMT过程实现对BCSCs的靶向治疗？本文就上皮-间充质可塑性与BCSCs之间的联系，以及针对这些过程的潜在治疗策略作一综述。

1 乳腺癌干细胞导致肿瘤可塑性

肿瘤内异质性可以由肿瘤干细胞理论解释，肿瘤干细胞可以由3个功能来定义：肿瘤的起始、长期自我更新能力和分化的能力[4]。当CSCs被注射到免疫缺陷的小鼠体内时，他们有能力比大量的、分化的肿瘤细胞更高效地产生肿瘤[5]，因此CSCs可以启动和促进原发肿瘤生长，驱动远端部位的转移。肿瘤干细胞最早是从急性髓系白血病患者的血液中分离出来的[6]，后来AL-HAJJ等[7]于2003年首次在乳腺肿瘤中使用CD24-CD44+的细胞表面标志物分离乳腺癌干细胞，在这个群体中，只有200个乳腺癌干细胞就能在免疫缺陷的小鼠中形成肿瘤。随后的十几年，科学家分离和鉴定出了各类BCSCs的标记物，包括了造血干细胞抗原CD133、CD90、CD166、上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、同源盒转录因子NANOG(nanog homeobox )、八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor，OCT4)、巢蛋白(nestin)、富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5，LGR5)、整合素相关蛋白(CD47)、乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)、蛋白C受体(protein C receptor，PROCR)、四跨膜蛋白8(tetraspanin 8，TSPAN8)、乳腺癌抵抗蛋白(ATP binding cassette subfamily G member 2，ABCG2)及SGCE(epsilon-sarcoglycan gene)[8-10]等，为实现BCSCs的靶向治疗提供了新的策略。

BCSCs存在至少2种不同的可逆的状态。第一种状态是间充质样状态，BCSCs表达细胞表面标志物CD24-CD44+，它们主要是静止的，低增殖的，位于肿瘤侵袭边缘，并表达间充质标志物，具有高侵袭能力；第二种状态是类上皮样状态，表达乙醛脱氢酶(ALDH)，具有高增殖潜力和多谱系分化能力，并表达上皮标志物，位于更中心的位置。间充质样BCSCs的基因表达谱类似于基底干细胞，而上皮样BCSCs的基因表达谱类似于正常乳腺的管腔干细胞[11]。虽然以CD24-CD44+或ALDH表达为特征的细胞之间存在显著差异，但这2个群体都具有肿瘤起始能力，这是它们共同的干性特征。而这2个群体通常是相互独立的，双阳性细胞比例在肿瘤中非常低，同时具有CD24-CD44+和ALDH标志物的BCSCs具有最大的致瘤能力。BCSCs具有可塑性，能够在EMT和MET状态之间转换，这种转变被认为是肿瘤转移的关键，并可能受到肿瘤微环境(tumor micro-environment，TME)中细胞因子信号调节[12]。

BCSCs与化疗耐药和乳腺癌转移复发有关。目前使用的大多数疗法针对的是高增殖的乳腺癌细胞，旨在杀死尽可能多的乳腺癌细胞以减少肿瘤大小，最初可能是有效的，但随着时间的推移，存活的BCSCs会导致肿瘤复发。BCSCs表达各种蛋白质如ABC转运蛋白，可以将药物泵出细胞，从而导致治疗耐药[13]。BCSCs的基因表达谱显示具有增加转移潜能的侵袭性基因特征[14]，在小鼠异种移植模型中，转移到肺的人乳腺癌细胞表达高水平的干细胞标志物CD44，强烈提示BCSCs的促转移作用[15]。肿瘤微环境也可以调节BCSCs异质性和可塑性，并进一步影响治疗耐药性，但BCSCs如何从EMT获得耐药性尚不清楚。

2 EMT促进乳腺癌转移和复发

EMT是上皮细胞改变其表型的过程，失去主要的上皮细胞特征，转换为表达间充质标志物的细胞。上皮细胞的特征是顶端-基底端的极性和相邻上皮细胞之间紧密的连接，表达钙黏蛋白E(E-cadherin)、紧密连接蛋白(claudins、ZO-1、occludin)、桥粒蛋白(desmoplakin)等特征性分子，有利于组织的完整性和稳定性；相反，间充质细胞表现为成纤维细胞样、拉长的和纺锤形的外观，表达钙粘蛋白N(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、纤维粘连蛋白(fibronectin)、基质金属蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)、基质金属蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2，MMP2)、α-肌动蛋白(α-SMA)等特征性分子导致更多的移动性来增加细胞的迁移能力[16]。通过形态的转变，细胞获得了迁移到目的地的能动性。EMT发生在各种生理和病理条件下，包括正常发育、组织形态发生和修复、组织重建、纤维发生和肿瘤发生。重要的是，EMT过程已经被证明与正常细胞和癌细胞中干细胞特性的获取有关系[17]，并增强了对化疗、电离辐射和激素治疗的抵抗力。

在EMT介导的癌细胞转移中，上皮状态相关基因表达受到抑制，同时激活间充质状态相关基因的表达。EMT使癌细胞获得侵袭能力，它们分泌有助于侵入的基质金属蛋白酶，细胞经历全身播散并到达继发性肿瘤部位，再经历MET过程，使间充质细胞恢复为上皮样细胞，癌细胞定植并形成转移灶——即EMT促进肿瘤扩散，而MET促进远端转移灶的形成[18]。

在该领域广泛传播的一种误解是EMT意味着从上皮细胞到间充质样细胞的完全转分化。然而，大量报告表明，大多数肿瘤中存在中间EMT状态，细胞在不经历完全EMT的情况下获得一些间质特性[19]，EMT和MET过程代表着动态上皮可塑性途径的两种最终终点状态。因此，中间EMT状态可能出现在转移的不同阶段，细胞在肿瘤扩散过程中通过混合E/M状态过渡。

未分化的乳腺干细胞，又称为肿瘤起始细胞，它们可以来源于经历EMT和随后的自我更新、扩散和继发肿瘤发生的基底乳腺上皮细胞(MECs)。发生EMT的细胞和干细胞的基因表达谱之间的惊人相似性也表明EMT与BCSCs的干性之间存在密切联系[20]。此外，肿瘤细胞中较高水平的EMT标志物不仅促进肿瘤侵袭和转移到远处，而且还由于其对化疗和放疗的相对抵抗力而导致肿瘤复发[21]。

3 EMT赋予乳腺癌细胞CSC特性

尽管有大量关于诱发EMT或干性的信息，但很少有研究精确地指出在机制上，EMT如何诱发干性。总体而言，EMT通过改变乳腺癌细胞的基因表达谱，调控与干性相关基因的表达，使得乳腺癌干细胞在肿瘤起始、转移、耐药和复发的各个方面都受到影响。

激活EMT程序可以直接增强肿瘤的起始，产生乳腺癌干细胞。Mani及其同事[2]的一项研究显示，在永生化的人乳腺上皮细胞中诱导EMT可以增加体外的乳腺球体形成和体内的致瘤性，EMT可能是控制CD44-CD24+细胞向CD44+CD24-细胞过渡的重要步骤，CD44-CD24+乳腺上皮细胞是非致瘤性细胞，可通过激活Ras/MAPK途径诱导EMT，获得CD44+CD24-干细胞特征[22]。多个EMT相关转录因子可以通过激活或抑制基因转录来调控EMT相关基因的表达，也促进干性基因的表达。此外，诱导EMT的相关通路如TGF-β、Wnt都诱导EMT的同时增加干性，激活相关干细胞信号通路。

EMT使得乳腺癌细胞某些特性发生转变从而促进了乳腺癌的转移。研究表明，发生EMT的肿瘤细胞具有很强的运动能力，常常与肿瘤细胞的高淋巴结转移、高侵袭性等有关，下调E-cadherin的表达能够明显增强乳腺癌转移能力，而给予外源性E-cadherin则抑制乳腺癌转移[23]。通过双重组酶谱系追踪系统，结合实时成像和RNA测序，在转移性乳腺癌MMTV-PyMT小鼠模型中跟踪经历部分或完全EMT的癌细胞，发现实际上是部分EMT状态介导结合了高效转移过程所需的可塑性和干细胞特征[24]。乳腺癌细胞经历EMT形成的CD44+CD24-BCSCs，也具有更强的转移能力。有研究表明，CD44在有肺转移的乳腺癌肿瘤细胞中的表达明显增加[11]。在CD44+CD24-BCSCs中，表达CD44异型(CD44v)的一个亚群的肺转移能力又明显高于表达CD44标准异型(CD44s)的亚群，通过调控上皮剪接调控蛋白1(epithelial splicing regulatory protein 1，ESRP1)的表达，增加或降低乳腺癌细胞的CD44v/CD44s比值，可在不影响癌细胞干性的情况下促进或抑制肺转移[25]。此外，TGF-β信号转导是促进肿瘤细胞EMT与侵袭迁移的主要诱因，研究表明短时间暴露在转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)刺激下，上皮细胞和癌细胞会发生可逆的部分EMT，导致间充质基因上调，播散和转移能力增强。后来发现在长时间TGF-β暴露的状态下，能激活mTOR信号通路，促进乳腺上皮细胞和癌细胞稳定的EMT，并且稳定的EMT伴随着稳定的干细胞生成和抗肿瘤耐药性的增强[26]。然而，EMT与干性和转移的联系仍在争论中。有新观点认为EMT在癌症转移过程中不是必须的，例如Liu等人[27]发现EpCAM+的细胞而不是EMT的细胞负责了乳腺癌的转移，ALDH+细胞也比ALDH-细胞具有更高的转移能力，这些研究结果提示临床模式应考虑基于其EMT表型的不同亚群作为多靶点治疗，以减少治疗耐药性和转移性增长。

经历EMT的乳腺癌细胞具有类似干细胞的特性，对多种治疗药物产生耐药性。部分和完全EMT细胞在原发性肿瘤的化疗后都富集，但与部分EMT细胞相比，完全EMT细胞对转移瘤的化疗更具抵抗力[24]。现在认为EMT诱导治疗耐药性主要是由于TGF-β和一些EMT转录因子(EMT transcription factor，EMT-TF)在激活促生存信号、增强DNA损伤修复、通过ABC转运蛋白促进多药耐药等方面发挥作用。TGF-β可以通过促进谷胱甘肽代谢从而降低治疗效果，提高肿瘤细胞的存活率[28]。过表达EMT-TF也证明可以增强ABC转运体的外排活性，从而促进多药耐药，并且EMT-TF如Twist家族BHLH转录因子(twist family BHLH transcription factor ，Twist)、Snail家族转录因子1(snail family transcriptional repressor 1，Snail)和叉头框C2(forkhead box C2，FOXC2)等在多个ABC转运蛋白基因的启动子区域都具有结合位点[29]。此外，EMT还与乳腺癌耐药蛋白ABCG2高度相关，ABCG2与N-cadherin表达呈正相关，与E-cadherin表达呈负相关，可能共同参与乳腺癌细胞的耐药及转移[30]。Snail1介导的EMT可以通过调节参与细胞死亡和维持细胞干性的基因，赋予癌细胞耐药性和细胞可塑性，提示治疗耐药的细胞可以通过激活EMT进入CSC状态[4]。抑制关键的CSC标记物，如ABC转运体、NANOG、CD44、Wnt、CD55、CD133、ALDH1、OCT4、SOX2(SRY-box transcription factor 2)或Kruppel样因子4(kruppel-Like factor 4，KLF4)，可使癌细胞对化疗敏感。

EMT与乳腺癌复发密不可分。增殖活跃的BCSCs(类上皮状态)在常规的放化疗中往往被杀灭，但静息状态的BCSCs(间充质状态)能够存活下来[12]。EMT的激活使得残留BCSCs引起肿瘤的复发。例如白细胞介素-30(interleukin-30，IL-30)可以通过C-X-C基序趋化因子10(C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10)和IL-23自分泌循环喂养乳腺癌干细胞，通过塑造免疫环境调节BCSCs活力[31]，乳腺癌患者术后排出的伤口液体中也富含大量的细胞因子，可以通过激活信号转导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信号通路进而诱导干细胞表型的乳腺癌富集，引起术后肿瘤的复发[32]。

这些研究证实了干性和EMT确实是错综复杂的，在肿瘤细胞中诱导EMT不仅促进干性，肿瘤细胞侵袭和转移，而且还有助于耐药性。因此，增加对EMT-BCSCs链接的机制理解将允许开发用于根除肿瘤的新疗法，以提高被诊断患有乳腺癌症的患者的总体生存率。靶向EMT以消除BCSCs为乳腺癌治疗提供了一个有希望的途径。

4 调节乳腺癌细胞干性和EMT的因素

4.1 转录因子

已有许多文献记载EMT相关转录因子，包括锌指蛋白家族Snails(Snai1，Snai2/Slug，Snai3/Smuc)、E-box结合蛋白Zebs(Zeb1/Tcf8，Zeb2/Sip1)、碱性螺旋-环-螺旋蛋白Twists(Twist1，Twist2)和叉头盒蛋白FOXCs(FOXC1，FOXC2)等可以通过激活或抑制基因转录来调控EMT相关基因的表达，进而调控肿瘤干细胞的基因表达，在维持干性方面发挥关键作用，特别是Twist和Snail。例如Wang等[33]研究表明转录因子Twist可以通过转录诱导蛋白酶激活受体1(protease activated receptor 1，PAR1)表达，抑制Hippo通路，激活Yes1相关转录调控因子(Yes1 associated transcriptional regulator，YAP)/具有PDZ结合基序的转录共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ)，诱导乳腺癌细胞发生EMT、侵袭、迁移、干性、肿瘤生长和转移。另一转录因子Slug也可以通过上调NF-κB/ HIF1-α轴，使乳腺癌细胞具有干细胞样表型[34]。

这些EMT-TF经常协同作用来调节共同靶基因的表达，还经常控制彼此的表达。例如，Snail是一个上游转录因子，可以诱导多种其他EMT-TF的表达，包括Slug、Twist1和ZEB1。另一方面，转录因子3(transcription factor 3，TCF3)作为一种下游效应因子，其表达受多种其他EMT-TF的诱导，如Snail、Slug和ZEB1[35]。由于这些相互作用，形成一个错综复杂的网络，最终在许多情况下诱导与EMT相关的基因谱变化。

EMT和干性之间的关系不是单行道。一些研究报道了肿瘤干细胞中关键转录因子对EMT的调控作用。干细胞关键转录因子SOX2在细胞命运决定中发挥中心作用，并在肿瘤发生和转移中作为调节因子发挥重叠作用，SOX2的表达可下调转移抑制因子miR-452，后者直接靶向Slug的3′UTR区抑制干细胞扩增[36]。另一干细胞转录因子OCT4也被报导在晚期乳腺癌患者中高表达，和Smad3形成异二聚体促进Snail、Slug的转录，与TGF-β信号通路共同诱导EMT[37]。在PyMT-TCF3条件基因敲除小鼠模型和衍生的原代肿瘤细胞系中TCF3的靶向敲除抑制了PyMT驱动的乳腺肿瘤的起始能力和去分化潜能，并严重损害了转移能力，机制研究表明E2A的作用是通过上调Snai1转录介导的[35]。除此之外，KLF4、Myc(BHLH transcription factor)、NANOG、Bmi1(B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog)等干性相关转录因子也被证明在EMT上发挥调节作用。有趣的是，KLF5转录因子也维持乳腺(癌)干性[38]，上调Slug的转录，但是KLF5并不促进EMT过程。这些结果说明EMT和干性虽然很多情况下耦联但是并不完全等同。

转录因子的表达在翻译和翻译后水平上受到调节，在非编码RNA、信号通路、肿瘤微环境等多个层面上受到不同的上游调控机制的控制，通过协同调控这些转录因子调控EMT和干性的激活(详见后叙)。

4.2 表观因子

4.2.1组蛋白修饰酶 越来越多的证据表明，许多组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶参与了乳腺癌EMT和细胞干性的调节。精氨酸甲基转移酶5(protein arginine methyltransferase 5，PRMT5)可以通过甲基化KLF5来阻止其磷酸化、泛素化及降解，从而促进乳腺癌干细胞的维持和增殖[39]。赖氨酸特异性去甲基化酶1(lysine-specific histone demethylase 1，LSD1)也发现能够在EMT中诱导广泛的基因表达谱变化，LSD1可能通过癌症相关成纤维细胞(cancer sssociated fibroblasts，CAFs)间接作用调节肿瘤微环境来调控BCSCs的自我更新[40]。事实上，众多的组蛋白甲基化修饰酶包括zeste同源物增强子2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)[41]、赖氨酸甲基转移酶5C(lysine methyltransferase 5C，KMT5C)[42]、核受体结合SET结构域蛋白3(NSD3)[43]、去甲基化酶PHD手指蛋白8(PHD finger protein 8，PHF8)[44]等都能与EMT-TFs相互作用，形成一个精细调控的网络，对众多相关基因表达产生调控。

EMT-TFs还受到组蛋白乙酰化的调节。例如在乳腺癌中，乙酰转移酶CREB结合蛋白(CREB binding protein，CBP)可以通过催化HAT结构域直接与Slug的C端结构域相互作用，介导Slug在转移性乳腺癌细胞中高度乙酰化[45]。异粘蛋白(metadherin，MTDH)也可以通过促进Twist1启动子上的组蛋白H3乙酰化而间接激活Twist1的表达，促进CSC积累和乳腺致瘤性[46]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)被证明可以通过抑制IL-6/STAT3和KLF5抑制乳腺癌转移和生长[47]。

在癌症进展过程中，泛素化和去泛素化通过异常信号放大发挥关键作用。E2泛素结合酶如UBE2O(ubiquitin conjugating enzyme E2O)[48]、E3泛素连接酶如COP1(constitutive photomorphogenic protein 1)[49]、HECTD1(HECT domain E3 ubiquitin protein ligase 1)[50]、CRL4B(cullin 4B)[51]等都被证明通过EMT和/或干性调节乳腺癌进程。此外，大量去泛素化酶(DUBs)也在其中发挥关键作用。例如在IL-6条件下，去泛素化酶DUB3能够对Snail和Slug去泛素化，稳定二者进而促进EMT和增加肿瘤细胞迁移、侵袭和转移[52]。相反，抑制去泛素化酶USP34可上调N-cadherin、p-Smad3、Snail和β-catenin，下调E-cadherin，导致侵袭性行为的获得，并通过增强乳腺球形成能力促进干细胞的形成，同时上调NANOG、OCT4和SOX2 mRNA的表达[53]。

4.2.2DNA甲基化 DNA甲基化是许多病理机制发生的根源。乳腺癌中的低甲基化和肿瘤抑制基因的高甲基化会增加患癌的风险，表观基因组学研究表明BCSCs和非BCSCs的DNA甲基化存在差异[54]。BCSCs相关基因CD44、CD133也被证明在原发性乳腺癌启动子区域中低甲基化，并与TNBC和浸润性乳腺癌相关[55]。EMT-TFs表达同样受DNA甲基化的调控，尤其是DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)介导的甲基化。Snail能与DNMT1、DNMT3a和DNMT3b相互作用，负责E-cadherin启动子上的DNA甲基化和转录抑制，阻断Snail介导的这种表观遗传调控会导致E-cadherin重新表达，逆转EMT[56]。同时，DNMT1对乳腺和肿瘤干细胞的维持和肿瘤发生至关重要，例如DNMT1介导的FOXO3a(forkhead box O3)启动子高甲基化导致乳腺癌中FOXO3a表达下调，而FOXO3a能通过抑制FOXM1/SOX2信号传导来抑制BCSC特性和致瘤性[57]。

4.2.3非编码RNA MicroRNA是高度保守的、小的非编码的、单链的20～25个核苷酸的RNA，可以通过翻译抑制或mRNA降解抑制靶基因的表达，在肿瘤的分化、增殖、凋亡等多种生物学过程中发挥重要作用。越来越多的证据支持miRNA与EMT相关，尤其是乳腺癌中的miR-200家族，包括了miR-200a/b/c、miR-141和miR-429等。过表达miR-200可导致癌细胞转移潜能降低，并通过其3’UTR区沉默Zeb表达，增强E-cadherin的表达，获得上皮特征[58]。此外，miRNA同时对BCSCs的多种细胞功能具有强大的影响，在BCSCs自我更新和分化的调控中发挥重要作用。提示miRNA在调节乳腺癌干细胞和EMT进展中发挥了重要作用(表1)。Wu等[59]提出EMT可以通过抑制miR-200c促进过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子α(PPARG coactivator 1 alpha，PGC1α)介导的线粒体融合蛋白(mitofusin 1，MFN1)的激活，MFN1与细胞极性蛋白复合物相互作用，介导内吞衔接蛋白(NUMB endocytic adaptor protein，NUMB)磷酸化和从皮质膜分离，指导不对称细胞分裂，增强谷胱甘肽的合成和活性氧清除能力，使自我更新的干细胞池得以维持，直接增强肿瘤的起始，产生BCSCs。除了miR-200家族之外，其他抑癌miRNA在BCSCs和EMT调控中也发挥了重要作用。维持细胞分化状态的miRNA let7可以抑制干细胞所需的因子，Wang等[60]证明Snai1的过表达导致miRNA let-7水平的降低，并足以将检测到的癌细胞表型向干细胞转移，Snai1的敲除会导致let-7表达的恢复、干性的减少和肿瘤的生长，提示EMT促进干性的一个机制是通过丢失let-7，破坏分化状态的稳定。

除了抑癌miRNA，大量促癌miRNA也发挥了重要作用。低氧微环境可诱导miR-210上调，通过靶向E-cadherinmRNA的开放阅读框区和上调Snail来抑制E-cadherin的表达，促进乳腺癌干细胞转移、增殖和自我更新[61]。miR-5188通过直接靶向FOXO1，增强Wnt/β-catenin/c-Jun信号通路，刺激已知的Wnt靶标、EMT标记物以及癌症干细胞的激活，原癌基因c-Jun还可以增强miR-5188的转录，形成正调控环，证明miR-5288在体内和体外诱导乳腺癌干细胞、增殖、转移和化疗耐药发挥致癌作用[62]。这些研究都表明，miRNA是调节EMT和细胞干性的重要表观遗传因子。

另一种长链非编码RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)在EMT和干性之间的调控也发挥了重要作用，LncRNA是一类长度超过200个核苷酸的转录产物，通过调控表观遗传、转录或转录后基因调控机制，在发育、稳态、干细胞多能性、细胞生长和凋亡、肿瘤转移等多种细胞过程中发挥重要作用。乳腺癌中，lncRNA在介导EMT和BCSCs中也发挥了重要作用(表2)。例如，缺氧诱导的Runt相关转录因子2(RUNX family transcription factor 2，RUNX2)可转录激活lncRNA RBM5-AS1，通过阻止β-catenin降解，在体内和体外促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、EMT和干细胞维持[83]。

表1 miRNA在调节乳腺癌干细胞和EMT进展中的作用Tab.1 The role of miRNA in regulating the progression of Breast cancer stem cells and EMT

lncRNA可以直接或间接地调节包括miRNA在内的其他非编码RNA的调控作用，其作用也有可能根据不同的miRNA发挥致癌或者抑癌的作用。例如LncRNA HOTAIR，可以通过调节miR-129-5p/FZD7轴[84]或miR-34a/SOX2轴[85]促进乳腺癌增殖、迁移、侵袭、EMT以及干细胞集落形成能力，也可以通过抑制HoxD10(homeobox protein Hox-D10)的表达间接下调miR-7的表达，通过直接靶向致癌基因SETDB1(SET domain bifurcated 1)，抑制细胞的侵袭和转移，减少BCSCs数量，并部分逆转了MDA-MB-231细胞中的EMT[76]。

4.3 关键信号通路

EMT过程和干性是多条信号转导途径和多种触发因素综合作用的结果，TGF-β、Wnt、Notch、Hippo、NF-κB、Sonic Hh(Shh)和IL-6/STAT3等信号通路均可以激活EMT并促进BCSCs产生(图1)。

表2 lncRNA在调节乳腺癌干细胞和EMT进展中的作用Tab.2 The role of lncRNA in regulating the progression of Breast cancer stem cells and EMT

图1 参与乳腺癌EMT和干性的相关信号通路Fig.1 Signaling pathways involved in EMT and stemness in breast cancer

4.3.1TGF-β信号通路 TGF-β信号通路在促进EMT和干性上发挥了至关重要的作用。早期肿瘤中，TGF-β主要表现为抑制肿瘤增殖，在肿瘤进展期又会促进肿瘤的侵袭转移[101]。在经典的Smad通路中，TGF-β信号激活Smad2和Smad3，并与Smad4结合，而Smad复合物将转移到细胞核内与转录因子一起介导靶基因的抑制或激活。在TGF-β信号介导的非Smad信号通路中，它可以激活PI3K-AKT-mTOR信号进行转录调控从而达到触发EMT的效果。TGF-β诱导包括Snail、Slug、Twist等多种EMT转录因子，因此，TGF-β被认为是在发育过程、癌症及其他病理状态下诱导EMT最重要的因子。

同时，TGF-β可以特异性的激活乳腺癌干细胞基因网络，促进乳腺癌扩散，与病人较差的存活率相关联。有学者证实乳腺癌细胞中的miR-30a与转录因子SOX4形成双负环，在体内外通过阻断TGF-β/Smad信号通路同时抑制乳腺癌中的EMT和干细胞样表型[102]。同样值得注意的是，Cdc2样激酶4(CDC like kinase 4，CLK4)沉默同样抑制了由TGF-β信号传导诱导的侵袭性和癌症干细胞特性[103]。辐射也可以诱导TGF-β信号的激活，表达Vimentin、Fibronectin、Snail、Slug、Twist、N-cadherin等EMT标志物，增强CSC特性和上调活性氧标志物NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)、4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)，增强体外和体内乳腺癌细胞的运动性[104]。TGF-β与Notch、Wnt/β-catenin、NF-κB和RTK等信号通路的相互作用参与了EMT的诱导，进一步帮助维持转移性肿瘤细胞的间充质表型和干性[105]。

4.3.2Wnt/β-catenin信号通路 Wnt/β-catenin通路的过度激活驱动乳腺癌的发生进展，也促进乳腺癌细胞发生上皮-间质转化。当Wnt分子与跨膜受体(Frizzled家族分子和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low-density-lipoprotein receptor related proteins 5/6，LRP5/6))结合后，通过受体与一系列胞质蛋白(轴抑制蛋白(axis inhibition protein ，AXIN)、大肠腺瘤息肉蛋白(adenomatous polyposis coli protein，APC)、糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)、β-连锁蛋白(β-catenin)等)的相互作用使β-catenin在胞浆内累积并转运入核，与核内转录因子TCF/LEF1(T-cell factor/lymphoid enhancer factors)共同作用，激活下游靶基因的转录，导致Snail的累积和E-cadherin下调，引发EMT。抑制Wnt通路可促进上皮分化并抑制Twist和Slug所致的EMT，而Wnt/β-catenin通路的异常激活可促进正常干细胞的恶性转化，多数β-catenin靶基因如YAP[106]、整合素α5(integrin α5，ITGA5)[107]等都可以促进干性特征的形成。

细胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)缺失可通过Wnt/β-catenin途径部分上调上皮细胞黏附分子EpCAM表达，从而促进部分EMT，增强乳腺癌干细胞性[108]。成体干细胞标记LGR5[109]、线粒体应激蛋白Mortalin[110]也被证明通过激活该经典信号通路，促进乳腺癌细胞迁移、肿瘤形成和EMT，维持BCSCs的干性。最近研究表明缺氧诱导的RUNX2可转录激活Wnt/β-catenin信号通路[111]，缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)还可以直接激活缺氧乳腺癌细胞的钙质网蛋白(calreticulin，CALR)转录，激活Wnt/β-catenin信号通路促进BCSCs，从而增加肿瘤的起始和转移[112]。

4.3.3Notch信号通路 Notch信号通路调控细胞增殖、分化、凋亡之间的平衡，在决定细胞命运和维持祖细胞群方面发挥重要作用。到目前为止，Notch受体、配体的突变、缺失、扩增或过表达，以及越来越多的下游Notch激活基因已经被描述为与大多数人类癌症相关。Notch通路是通过Delta-like(DLL1、DLL3、DLL4)和Jagged(JAG1、JAG2)家族成员作为配体与Notch受体(Notch1-Notch4)结合而激活的，这种结合通过γ分泌酶触发一系列蛋白水解切割事件，产生活性Notch细胞内结构域(notch intracellular domain，NICD)易位到细胞核，与其他转录激活剂结合激活典型的Notch靶基因的转录。

在乳腺癌中，Notch信号通过多种机制激活EMT和干性。Notch1信号通路激活Slug表达，促进乳腺癌细胞迁移和侵袭，Notch1的过表达还激活STAT3诱导CSC样表型和EMT[113]。Notch4在三阴性乳腺癌中的异常高表达和激活也有助于间充质型BCSCs的维持，通过转录上调Slug促进EMT。Notch4标记ML-BCSCs的效率明显高于目前常用的CD24-CD44+标记物，成为肿瘤干预的潜在靶点[114]。相反，部分Notch受体起抑制作用，例如HIF1α可以接结合Notch3启动子上调Notch3的表达，随后通过降低表达Notch3的乳腺癌细胞中IL-6的水平从而下调BCSCs[115]。还有一些miRNAs对Notch诱导的EMT和干性有负面影响。miR-34a通过下调Notch1负向调控细胞增殖、迁移、侵袭和乳腺癌干细胞增殖，miR-34a的表达与乳腺癌组织中肿瘤分期、转移及Notch1的表达呈负相关[116]。

4.3.4NF-κB信号通路 肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一种参与炎症、免疫、细胞稳态和肿瘤进展的促炎细胞因子，参与肿瘤发生的所有步骤，它激活NF-κB，诱导如Snail，Slug，Twist，ZEB1和ZEB2等EMT相关因子的转录。TNF-α可迅速诱导正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞中Twist1 mRNA和蛋白的表达，且Twist1的表达需要IKK-β和p65的参与[117]。EMT相关的TF Twist2转录也可以导致NF-κB的活化，反过来上调Twist2的表达，从而实现一个正反馈回路，激活EMT，并增强基底样乳腺癌中的癌症干细胞样特性[118]。此外，EpCAM的糖基化修饰也被证明通过促进乳腺癌细胞中的NF-κB，在缺氧条件下诱导干性和EMT[119]。一些miRNA同样可以通过NF-κB通路调控表达，例如细胞外囊泡中包裹的miR-370-3p通过与CYLD的3'UTR结合下调表达，激活NF-κB信号通路，乳腺癌细胞来源的外泌体还能促进正常成纤维细胞的激活，而活化的成纤维细胞促进癌细胞的干性、迁移、侵袭和EMT的增强[120]。miR-221/222通过靶向PTEN，进而激活Akt/NF-κB/COX-2通路，促进乳腺癌细胞生长、迁移和侵袭，在BCSCs增殖和肿瘤生长中发挥关键作用[121]。有研究还发现TNF-α还可以通过激活非经典NF-κB通路，上调TAZ表达从而增加乳腺癌干性[122]。

4.3.5Hedgehog信号通路 Hedgehog(Hh)信号通路对细胞命运的决定和自我更新至关重要。Hh通过跨膜蛋白Patched(ptch)和Smoothened(Smo)两种受体信号发挥作用，Smo起到中间桥梁作用。当无Hh信号时，神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白(glioma-associated oncogene homologue, Gli)被水解成小片段进入细胞核抑制靶基因的转录；当Hh与Ptch结合时，对Smo的抑制效应解除，Gli降解作用被抑制，Gli继而从复合体中释放出来进入细胞核中启动相关基因的表达。Hh参与多种类型癌症的发生发展，并负责细胞干性的维持。Zhu等[9]发现TSPAN8可以与PTCH1相互作用，通过招募去泛素化酶ATXN3抑制SHH/PTCH1复合物降解，导致Smo易位到纤毛，促进干性基因的表达并增强小鼠的肿瘤形成。此外，p63可以通过直接结合Shh、Gli2和Ptch1的基因调控区域正向调节并维持BCSCs的自我更新[123]。

同时，大量研究证实Hh信号通路激活与EMT发生有关。表达各种EMT-TF(Snail，Twist，或Zeb1)或敲低E-cadherin，激活EMT程序，可诱导正常和转化乳腺上皮细胞发生初级纤毛，而EMT可以通过诱导初级纤毛发生和Hedgehog信号通路促进基底乳腺干细胞和肿瘤起始细胞干细胞[124]。在乳腺癌细胞中，激活Hh信号通路后肿瘤侵袭转移增加，并且CSC相关标记物SOX2、NANOG、OCT4和ALDHA1表达上调，乳腺球形成效率、体外自我更新能力和体内致瘤性提高[88]。抑制含溴结构域蛋白4(bromodomain containing 4，BRD4)[125]或敲除泛素特异性蛋白酶37(ubiquitin specific peptidase 37，USP37)[126]也被证明均可显著降低Hh途径成分Smo和Gli-1，从而抑制乳腺癌的干细胞性、细胞侵袭和EMT。有趣的是，最近几年研究还发现在乳腺癌模型中，EMT细胞可以通过激活Hh通路的Gli转录因子诱导弱转移的非EMT肿瘤细胞以旁分泌的方式增加转移，但Smoothened抑制剂并不能阻断这种作用[127]。

4.3.6Hippo信号通路 Hippo信号通路也是调控肿瘤发生发展的关键通路，在乳腺癌细胞的增殖、分化、侵袭、上皮间质转化和干性维持等多个过程起着关键性作用。哺乳动物STE20样激酶1/2(mammalian sterile 20-like kinase 1/2，MST1/2)、适配器蛋白Salvador同源物1(salvador homolog 1，SAV1)、大肿瘤抑制基因1/2(large tumor suppressor1/2，LATS1/2)以及重组人MOB激酶激活因子1(MOB kinase activator 1，MOB1))构成Hippo信号通路的核心反应链，彼此之间通过特定的保守结构或磷酸化位点相互作用，抑制下游转录共激活因子YAP/TAZ。在乳腺癌中，YAP/TAZ作为Hippo信号级联的效应因子，可以将癌细胞重组为肿瘤干细胞，促进肿瘤的起始、进展和转移，同时YAP/TAZ也是细胞物理性质的主要传感器，接收来自组织结构和周围细胞外基质的机械信号[128]。

乳腺癌细胞的自我更新和肿瘤起始特性需要内源性TAZ，而TAZ水平的提高促进了CSC特征，将原本良性的实验肿瘤转化为更具侵略性的组织病理学表型。TAZ还可能部分通过增加KLF5的稳定性来维持BCSCs的干性[129]。通过抑制YAP/TAZ活性，还可以抑制三阴性乳腺癌细胞EMT和迁移。肿瘤抑制因子CYLD通过协同抑制YAP/TAZ和TGF信号通路抑制乳腺上皮细胞向间质转化[130]。近年来，开发靶向Hippo通路的抗癌疗法已成为一个研究热点，但目前没有相关药物进入临床，因此，明确Hippo通路调控机制是分子靶向治疗研发的重要基础。

4.3.7IL-6/STAT3信号通路 乳腺癌患者IL-6水平的升高往往与生存期较差相关。IL-6是一种多效能细胞因子，能诱导STAT3活化并将细胞外的信号传递到细胞核，通过诱导靶基因转录发挥生物学效应，与EMT程序的诱导和增强干性基因相关。三维培养实验和原位异种移植模型表明，IL-6有效地促进了雌激素受体α(ERα)阳性的人乳腺癌细胞的EMT表型，在体外表现为侵袭性增强，肿瘤细胞增殖指数升高，在体内表现为组织学分级高，分化差[131]。IL-6通过激活STAT3信号转导可以激活原癌基因PIM1的表达，促进细胞侵袭、上调EMT和干细胞标志物的表达，而抑制STAT3的激活可以消除这种诱导作用[132]。IL-6还通过STAT3介导自主调节线粒体超氧化物水平，维持乳腺癌细胞的干细胞样活性[133]。已获审批药物托珠单抗[134]、中药魁蒿提取物5-去甲基青花素[135]、商陆根提取物[136]等都证明可以通过IL-6/STAT3信号来抑制乳腺癌EMT和干性。

4.4 肿瘤微环境(TME)

肿瘤微环境是肿瘤细胞赖以生存的复杂环境，包含了免疫细胞、基质细胞、细胞因子和生长因子以及细胞外基质等多种因素，存在显著低氧、酸性、高压等生理特点，这些环境因素通过改变细胞的自我更新途径或通过阻断关键转录调控因子的表达，对肿瘤的上皮-间质转化(EMT)、间质上皮转化(MET)、肿瘤干细胞的产生以及最后的远端定植都有重要的作用，从而影响肿瘤组织的恶性进展。

4.4.1免疫细胞 肿瘤细胞能招募许多天然免疫系统的细胞成分，如巨噬细胞、髓源性抑制细胞、调节性T细胞等，这些细胞通过释放可溶性介质形成肿瘤细胞自身局部环境。肿瘤微环境中的巨噬细胞和肿瘤干细胞之间存在潜在相关性，巨噬细胞作为一个重要中枢，汇聚了许多干性和EMT调节因子的功能。通过单核细胞和乳腺癌细胞共培养的研究以及癌细胞在巨噬细胞衍生出的条件培养液中生长的研究揭示巨噬细胞及其释放的因子对重塑过程的影响。耗尽小鼠乳腺脂肪垫中的巨噬细胞严重损害了乳腺发育中的干细胞能力，几乎完全阻断了小鼠模型中肿瘤的启动[137]，单核细胞与乳腺癌细胞之间形成的接触以及巨噬细胞释放的因子对乳腺癌细胞的干性和EMT具有重要的促进作用。例如，Lu等[138]的一项研究表明，在乳腺癌患者的活检组织中CD68+巨噬细胞位于CD90+肿瘤细胞附近，并且巨噬细胞增强了CD90+CSCs细胞的肿瘤启动，具有CSCs和EMT的特征，肿瘤细胞表达CD90是肿瘤细胞与巨噬细胞之间产生物理接触所必需的，这些相互作用增加了癌细胞IL-6、趋化因子CXCL8和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)的表达。同时，炎性细胞因子维持CSCs水平，重组IL-6和CXCL8增加CD90+肿瘤细胞形成肿瘤球体，维持干细胞状态[138]。肿瘤相关巨噬细胞还可以通过高表达的跨膜蛋白LSECtin与其受体相互作用从而增强乳腺癌的干性，靶向这一点也可能为乳腺癌提供潜在的治疗[139]。

除此之外，巨噬细胞在不同的组织环境中可分化为两种截然不同的极化状态：经典活化的M1型巨噬细胞和替代活化的M2型巨噬细胞，在功能和表型上表现出极大的差异，在EMT和干性调节上也发挥着不同的功能。M1型巨噬细胞是Th1型免疫反应过程中产生的效应巨噬细胞，主要由LPS或IFN-γ诱导，高表达IL-12、IL-23，分泌一氧化氮、反应氧中介物等杀伤分子、多种炎症因子(IL-1、IL-6、IL-13和TNF-α等)及趋化因子(CCL2、CCL3、CXCL-10等)来吸引CD8和Th1，具有高抗原递呈能力，参与Th1型免疫应答，杀伤感染病原体[140]。在肿瘤微环境中，M1型巨噬细胞通过分泌炎性因子，活化适应性免疫应答而起到杀伤肿瘤细胞的作用。而M2型巨噬细胞主要由IL-4、IL-10、糖皮质激素等诱导，发挥抗炎的作用，抗原提呈能力差，同时它还可分泌免疫抑制性细胞因子，抑制其它免疫细胞的增殖与活化。当考虑到调节干性和EMT的巨噬细胞的类型时，发现M1型巨噬细胞(主要来自外周血单核细胞，PBMC)的条件培养液被添加到Lumina-A乳腺癌细胞中时，肿瘤细胞获得了CSCs表型、EMT特性和更强大的迁移[141]。另一实验证明天然化合物大黄素通过抑制TGF-β1诱导的几个转录因子如FOXC2、NANOG、OCT4、Jagged1和KLF4的表达，阻断乳腺癌细胞和巨噬细胞之间的促肿瘤前馈作用，减少了巨噬细胞向肿瘤的募集和随后的M2样极化，从而改善了肿瘤微环境的免疫抑制状态。当大黄素在肿瘤细胞接种后不久给小鼠使用时，它可以抑制乳腺肿瘤的生长；而当大黄素在建立的肿瘤之后开始治疗时，它对原发肿瘤的生长没有影响，但显著减少了肺转移[142]。因此，巨噬细胞可以通过协调促炎和免疫抑制信号调节CSCs的启动和维持，M1型巨噬细胞可以诱导分化为CSCs，而M2型巨噬细胞对维持干性有较大的贡献。

此外，诱导上皮性乳腺癌的免疫反应，可以在体内导致肿瘤的T细胞依赖性生长，且伴随着EMT的发生，表明EMT可以由CD8+T细胞所诱导，产生的间充质肿瘤细胞具有CD24-CD44+表型，具有BCSCs的特征，具有强致瘤性、高上皮肿瘤重建能力以及对药物和辐射的耐药性增强[143]。有趣的是，最近的研究发现CD8+T在免疫逃逸方面也发挥了作用。用Concanamycina预处理破坏CD8+T的溶解颗粒后和乳腺癌细胞共培养，基因表达分析显示细胞程序性死亡因子配体1(programmed death ligand 1，PD-L1)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(indoleamine 2,3-Dioxygenase 1，IDO1)、癌胚抗原相关细胞附着分子1(CEA cell adhesion molecule 1，CEACAM1)和进一步的免疫调节检查点同时诱导乳腺癌细胞，增加了干细胞样癌细胞的比例，这种干细胞样特性的诱导通过增强免疫缺陷小鼠的肿瘤形成能力也得到证实，该机制表明无效的免疫反应不仅不能清除恶性肿瘤，而且还可以激活癌细胞中促进干细胞生长和肿瘤播散能力的途径，为不成功的免疫治疗导致的临床过度进展现象提供了可能的解释[144]。

CSCs还可以通过改变TME中IL-6和IL-8以及CCL5等细胞因子的产生来影响辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)/调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)平衡，调控EMT和干性的关键转录因子STAT3是Th17分化和Treg抑制的关键转录因子[145]。CSCs和Tregs之间存在正相关，表明这些细胞群之间可能存在串扰以促进免疫抑制环境。Tregs还通过细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA-4)、IL-10和TGF-β的表达，通过TAM介导的EMT诱导促进CSC的扩张[146]。

人和小鼠乳腺CSCs也易受NK细胞毒活性的影响，BCSCs在体内诱导了自体NK细胞的活化和扩增，这与抑制CSC的转移扩散有关[147]。但并非所有乳腺癌来源的CSCs都对NK细胞毒性有抗性。最近有报道称，来源于人类乳腺癌的ALDH+CSCs，由于miR20a的表达，可以通过下调杀伤细胞凝集素样受体K1(killer cell lectin like receptor K1，KLRK1)的配体MHC I类多肽相关序列A(MHC class I polypeptide-related sequence A，MICA)和MICB来逃避NK识别，促进了BCSCs对NK细胞毒性的抵抗并导致肺转移[148]。

4.4.2脂肪细胞 脂肪组织除了能量储存的主要功能以外，还是一个复杂的内分泌器官，脂肪细胞也是肿瘤微环境中丰富和活跃的主要成分，在乳腺癌的形成和进展中发挥重要作用。脂肪细胞产生各种各样的脂肪因子和信号因子，如CXCL2、TNF-α、IL-6、瘦素等，促进肿瘤细胞的自我更新能力和转移能力。Wang等[149]研究发现人类脂肪细胞来源的瘦素可以激活乳腺癌JAK/STAT3信号通路，STAT3磷酸化入核后与肉毒碱棕榈酰基转移酶1B(carnitine palmitoyltransferase 1B，CPT1B)启动子结合促进其转录，促进脂肪酸β氧化从而重塑肿瘤脂质代谢，促使乳腺癌干性，诱发化疗抵抗。此外，在MMTV-Wnt-1转基因小鼠模型上验证了增加的瘦素信号通过促进肿瘤干细胞富集和上皮-间质转化来驱动肥胖相关的TNBC的发展。脂肪细胞还可以通过旁分泌IL-6/STAT3信号诱导乳腺癌细胞上皮间质转化[150]。袁增强团队研究揭示了在饮食诱导的肥胖症中，脂肪细胞TAZ通过FFA/PPARγ轴的特异性上调。小鼠脂肪细胞TAZ基因敲除或缺乏通过抑制抵抗素的表达和分泌来抑制脂肪细胞诱导的乳腺癌的增殖和干化[151]。目前，脂肪细胞在乳腺癌中的研究还不成熟，随着脂肪细胞-癌症相互作用调控机制的阐明，可能会发现新的药物靶点。

4.4.3肿瘤相关成纤维细胞 肿瘤相关成纤维细胞作为乳腺肿瘤微环境中主要的基质细胞类型，和癌细胞之间有一种动态相互作用。不同的分泌信号分子将CAF与非肿瘤组织成纤维细胞区分开来。在生物学水平上，CAF表现出一种“激活”的表型，参与癌细胞EMT程序激活[152]。

近年来的几篇报道提示了CAF激活调节附近癌细胞中EMT程序和干性的潜在机制。CD10+GPR77+CAFs可以通过p65磷酸化和乙酰化而持续激活NF-κB通路，维持癌症干细胞以促进癌症形成和化疗耐药[153]。与正常成纤维细胞相比，CAF与乳腺癌细胞共培养可以刺激成纤维细胞产生更高水平的CCL2，激活STAT3，进而诱导NOTCH1表达，刺激乳腺癌细胞干细胞特异性、球形表型和CSC自我更新[154]。

CAFs还可以分泌富含蛋白质、RNA的外泌体来影响肿瘤微环境。研究表明，与正常乳腺上皮细胞相比，乳腺癌细胞通过外泌体释放更多的生存蛋白(survivin)到细胞外，而激活成纤维细胞，活化的成纤维细胞在体内外都能促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、EMT和干细胞分化[155]，来自CAFs的含有microRNA -181d-5p的外泌体也可以通过调控CDX2/HOXA5促进乳腺癌EMT[156]。

CAFs最近还因其作为免疫细胞募集的调节者而引起关注。与正常成纤维细胞相比，CAFs是表达α-SMA的成纤维细胞，可以由单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)介导有效的招募单核细胞，并表现出较强的免疫抑制，表明CAFs在塑造乳腺肿瘤微环境中发挥着关键作用[157]。最新研究还发现在乳腺CSCs中高表达的一种小GTPase Rab13可以控制CXCR1/2的膜转位，使肿瘤细胞与肿瘤相关的巨噬细胞和癌症相关的成纤维细胞相互作用，建立一个支持性的BCSC生态位促进乳腺癌干性[158]。

4.4.4细胞因子 肿瘤微环境中大量的细胞因子和趋化因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、CXCL8、CXCL1等[63]可以通过旁分泌信号来增强CSCs的活性，参与干性和EMT的调节。在许多研究中，TNF-α直接促进乳腺癌细胞和未转化的乳腺上皮细胞的干性、EMT和转移，TNF-α也可以与其他因子如TGF-β、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)联合使用[159]。除了TNF-α，IL-6也诱导了乳腺癌细胞干性的获得[160]，JAK/STAT3、Notch通路等都被认为介导了IL-6诱导的乳腺癌细胞的干性的事件中起到关键作用。此外，在乳腺癌中发现趋化因子CXCL8-CXCL1/2轴对干性的影响是通过Src反式激活HER2和EGFR来实现[161]。与CXCL8类似，CXCL1被发现以自分泌的形式或由癌细胞附近的巨噬细胞分泌促进细胞干性[162]，且从机制上，NF-κB、STAT3和MAPK几种不同的信号通路参与了CXCL1诱导的EMT过程。

4.4.5酸性肿瘤微环境 肿瘤微环境一显著特征就是细胞外酸中毒，pH值在6.5～6.9范围内，而正常组织常为pH7.2～7.5的碱性外环境。酸性微环境可通过破坏肿瘤的黏附连接，有利于肿瘤的生长、转移。酸性微环境下肿瘤细胞的原癌基因Src被激活，通过进一步激活蛋白激酶C-δ(protein kinase C-δ，PKC-δ)破坏p-120连环蛋白介导的黏附连接，并降解E-cadherin，使肿瘤细胞与细胞的接触松散，增加细胞运动和迁移，促进肿瘤转移[163]。后续研究证明，在不依赖于低氧环境条件下，酸性微环境还可以维持肿瘤干细胞的自我更新能力和未分化状态，使细胞获得多能性[164]。乳腺癌干细胞的功能标志物ALDH1A1也可以通过降低胞内的pH值，促进转化生长因子激酶1(TGF-beta-activated kinase 1，TAK1)磷酸化，激活NF-κB信号，并上调GM-CSF的分泌，导致骨髓源性抑制细胞的富集，增强对杀伤性T细胞增殖和活化的抑制作用，促进肿瘤生长[165]。

4.4.6缺氧 缺氧会影响EMT相关基因表达，进一步诱导干细胞表型。氧稳态在癌发生和肿瘤进展中起着关键作用。正常组织中足够的氧气供应使细胞存活，而在肿瘤组织中，由于肿瘤细胞具有无限的增殖能力，在生长过程中需要消耗大量的能量和氧气，处于低灌注状态，造成微环境缺氧。

低氧通常出现在肿瘤血运不良的区域，HIF通过上调EMT相关转录因子，激活EMT相关信号通路，调控EMT相关炎症因子，以及调控其他通路引发EMT。有证据表明，HIF通过诱导E-cadherin、SNAIL、ZEB1、Twist和TCF3[166]的转录调控抑制E-Cadherin的表达，从而赋予癌细胞间质属性，诱导EMT。HIF-1还能通过诱导TGF-β、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT和Notch等信号通路激活EMT。研究表明，抑制GSK-3β和激活PI3K/Akt通路也可能通过短暂的细胞内活性氧生成增加和HIF-1/VEGF依赖性通路参与缺氧介导的EMT。GSK-3β还可以调控SNAIL易位，控制E-cadherin转录抑制[167]。通过调节乳腺癌细胞中的长链非编码RNA Lnc RBM5-AS1[111]也可以调引发缺氧微环境中EMT。此外，研究表明，人乳腺癌细胞在缺氧培养条件下仅暴露2天就足以使BCSCs的百分比增加2倍[168]，KLF4、NANOG、OCT4和SOX2基因表达增加，提示缺氧在调节EMT与细胞干性之间可能存在某种关系。缺氧诱导EMT在肿瘤组织中的出现，而肿瘤细胞在缺氧微环境中表现出干细胞阳性特征。

4.4.7营养与代谢 Warburg效应表明即便在氧气充足的情况下，肿瘤细胞依旧采取有氧糖酵解的方式代谢葡萄糖，而其中葡萄糖的含量直接影响肿瘤干细胞的存活，是维持癌细胞干性的关键。早期研究发现，肿瘤干细胞相较于分化的肿瘤细胞，葡萄糖的摄取、糖酵解酶的表达、乳酸生产量及ATP含量显著增加，进行高水平糖酵解进而活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平降低，维持干细胞的稳态[169]。例如调控糖酵解基因表达的关键转录因子ETS变体基因4(ETS variant transcription factor 4，ETV4)缺失后，显著抑制了己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDHA)等糖酵解酶的表达，降低乳腺癌细胞对葡萄糖的摄取和乳酸的释放，而ETV4在BCSCs中富集则通过增强糖酵解活性促进乳腺癌细胞干细胞样特征[170]。但随着研究进展，大量证据表明一部分的肿瘤干细胞更偏向于氧化磷酸化而不是糖酵解，具有更低的葡萄糖消耗速率和乳酸产生，但产生更多的ATP[171]。肿瘤干细胞主要依赖糖酵解还是氧化磷酸化，在不同的肿瘤中并不确定。

有氧糖酵解的代谢重编程可由转录因子网络驱动。已经确定的乳腺癌干细胞促进因子如C-Myc[172]、HIF-1α[173]都是促进糖酵解的关键转录因子，通过驱动靶基因的表达参与代谢重编程。激活的HIF-1α不仅能诱导多能相关转录因子(Oct-3，NANOG、SOX-2等)、糖酵解(葡萄糖转运蛋白1/2(glucose transporter 1/2，GLUT1/2)、磷酸甘油酸酯激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK1)、丙酮酸激酶(pyruvate Kinase，PKM)等)相关基因的表达，还可以刺激EMT相关分子(Twist、Snail、MMPs、TGF-α等)的表达，在自我更新能力、生存、能量代谢改变、癌细胞的侵袭和转移和治疗耐药性等方面发挥关键作用(PMID: 33850556)[173]。增强的有氧糖酵解产生过量的末端产物乳酸，并对氧化磷酸化产生抑制作用，因此ROS生成减少，从而驱动细胞迁移和细胞骨架重塑，促进了EMT表型的形成和远处转移。一些糖酵解酶如果糖二磷酸醛缩酶A(fructose-bisphosphate aldolase A，ALDOA)、M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2，PKM2)、LDHA、LDHA参与上皮标记物的丢失和间充质标记物的获得，在调节肿瘤代谢的同时，促进癌细胞的间充质转化[174]。有研究表明，肿瘤干细胞不同亚群的代谢模式也不同，与上皮样肿瘤干细胞相比，间充质样干细胞更倾向于糖酵解[11]。

肿瘤干细胞中的脂肪酸代谢也逐渐成为研究热点，研究显示，BCSCs中脂肪酸代谢相关酶的表达和活性明显上调，通过脂肪酸β-氧化调节脂质代谢，高脂饮食能够增强BCSCs的致瘤能力和恶性转化[149]。研究发现胆固醇合成增加可以促进乳腺癌细胞干性，与磷脂代谢相关的lncRNA ROPM可以促进BCSCs的磷脂代谢和游离脂肪酸的产生，从而激活PI3K/AKT、WNT/β-Catenin和Hippo/YAP信号，最终参与BCSCs干性的维持[175]。脂质代谢也可以影响乳腺癌细胞的可塑性和转移。通过蛋白质组学和脂质组学的方法研究上皮和间充质乳腺癌细胞，发现上皮细胞表现出高水平的单不饱和脂肪酸以及脂肪酸从头合成酶的表达增加，而间充质细胞显示脂肪生成减少、高水平的多不饱和脂肪酸以及参与三酰甘油合成和脂滴形成的基因表达增加[176]。提示脂肪酸氧化和脂质储存之间的相互作用可能是细胞状态变化过程中代谢可塑性的一种表现，类维生素a结合同源核受体可以靶向脂质代谢基因，从而将脂肪酸在间充质细胞状态下的β-氧化定向到上皮细胞状态下的脂质储存。在动物模型中，对脂肪酸氧化的扰动会重新引导脂肪酸通量，促进更多的上皮细胞表型，从而阻断EMT驱动的乳腺癌转移[177]。

4.4.8细胞外基质 细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是肿瘤微环境的关键组成部分，由蛋白质与糖类等生物大分子在细胞表面或细胞间构成复杂的网络结构，为肿瘤提供结构上的支持和保护作用。同时，肿瘤细胞影响ECM不断地动态重塑，为肿瘤组织的生长提供了合适的基质微环境。

ECM的主要组成成分包括胶原蛋白、糖蛋白、多糖等均可调节乳腺癌细胞的EMT和干性，影响肿瘤的侵袭、转移以及化疗抵抗。在胶原蛋白构成的3D微环境中生长的乳腺癌细胞呈现出更强的干细胞特性，上皮间质转化能力以及癌细胞的致瘤能力[178]。胶原蛋白还可以通过形成刚性ECM后激活AKT/mTOR信号通路，进而增强ERα+BCSCs的干性并促进肺转移灶的形成[179]。乳腺癌干细胞还能够自觉分泌糖蛋白例如层粘连蛋白(laminin，LN)与表面的整合素结合后激活TAZ信号，促使更多LN的分泌以维持干性[180]。然而，LN也被证明可以通过激活MAPK/ERK信号通路降低BCSCs的比例[181]，LN对BCSCs的不同调节作用可能与培养环境间的差异有关。ECM中另一常见的黏附性糖蛋白纤连蛋白(fibronectin，FN)在乳腺癌细胞中也被证明可以通过和整合素结合来诱导自身EMT，促进自身转移并增加干细胞标志物CD44的表达[182]。其中ITGB4作为乳腺干细胞标志物，被认为可以作为一个标记来识别CSC富集的部分间充质癌细胞群，和部分EMT密切相关[183]。CSC表面的CD44分子被认为是多糖成分透明质酸(hyaluronic acid，HA)受体，CD44和HA结合可以启动下游信号通路转导，调节BCSCs的特性和功能。有研究发现CD44+BCSC可以产生大量的HA，同时也会上调EMT标志物，沉默Twist表达或抑制TGF-β/Snail信号通路可以阻断进入干细胞状态的途径[184]。探究ECM中不同组分对BCSCs的影响，阐明其在肿瘤进展中的作用，是靶向肿瘤治疗的新研究趋势。

4.4.9细胞外囊泡 细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是由各种类型的细胞分泌的纳米级颗粒，它携带包括蛋白质、DNA、RNA、脂质等多种生物活性物质，介导细胞间通信，并调节包括细胞增殖、存活和转移等多种细胞过程[185]。最近一项研究表明，间充质干细胞分泌的细胞外囊泡可以指导乳腺癌细胞逐步去分化，从而进入骨髓血管周围区域休眠。胞外囊泡在与乳腺癌细胞接触后，细胞外囊泡的内容物发生了改变，使其完全去分化为一个具有CSC特性的群体[186]。脂肪细胞来源的EVs也可以通过调控HIF-1α的活性，增强ER阳性和三阴性乳腺癌细胞的生长、运动、侵袭、干细胞样特性以及上皮向间充质转化的特异性[187]。除此之外，化疗也能够诱导乳腺癌细胞分泌多种EV miRNA，包括miR-9-5p、miR-195-5p和miR-203a-3p，这些miRNA同时靶向Onecut转录因子家族ONECUT2，导致CSC特征的诱导和干性相关基因包括NOTCH1、SOX9、NANOG、OCT4和SOX2的表达[188]。EMT也可以在TME中被EVs诱导。例如，亚油酸处理的转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的EVs可在非致瘤性MCF10A细胞中启动EMT样表型转换，增加N-cadherin、Snail1/2、Twist1/2和Vimentin表达[189]。CAF释放的外泌体也可以使乳腺癌细胞系更高效地形成微球体，上调干性相关转录因子，并通过ZEB1诱导促进EMT[190]。鉴于EVs在乳腺癌进展中的重要作用，探索其作用机制可能有助于未来设计精准导向的药物，对转移性乳腺癌患者的预后产生积极影响。

4.4.10刚性和硬度 最近研究强调，除了来自微环境的生化线索外，物理线索也可以极大的改变细胞行为，如增殖、干细胞特性和转移潜能。肿瘤微环境中的基质细胞可以和癌细胞协同工作，积极改变ECM的物理性质，细胞外基质的沉积、修饰和重塑增加，会产生高度纤维化的肿瘤微环境和增加的基质刚性，从而进一步促进肿瘤的进展。为了研究ECM在3D物理微环境中对CSC的影响，大多使用由壳聚糖与藻酸盐构成的3D仿生支架或胶原涂层聚丙烯酰胺水凝胶3D Matrigel覆盖培养系统来模拟ECM的空间结构，

目前认为ECM硬度可通过机械信号转导调节CSC干性，随着ECM的硬度增加，CSC的干性也逐渐增[191]。YAP/TAZ常作为细胞微环境中机械信号的传感器和中介[192]，基质的硬度通过物理机械刺激抑制Hippo通路活化，激活YAP/TAZ促进干性和EMT。此外，Fattet等人的研究成果发现了EphA2/Lyn/Twist1信号通路，由细胞外基质的机械力激活，促进上皮-间充质转化和细胞侵袭，高ECM刚性激活酪氨酸蛋白激酶LYN并促进EMT和侵袭，LYN直接磷酸化Twist1，促进Twist1的核定位进而促进EMT和乳腺癌转移[193]。

5 靶向EMT和BCSCs的治疗策略

BCSCs具有高度异质性和可塑性，可以迅速再生靶细胞群，对于化疗或者放射治疗表现出较高的耐药性。BCSCs在E型和M型状态下的动态平衡表明，单独针对任何一种状态的治疗方法可能不足以消除BCSCs。一方面，携带EMT表型的癌细胞经过长期治疗后可能转化为耐药细胞，另一方面，EMT可能会诱导CSCs的产生具有抗药性。此外，EMT还可以通过血管内和外渗途径引起癌细胞的远处转移。下面介绍几种潜在的治疗手段及药物，将这些治疗手段与传统的放化疗结合可以有效的靶向BCSCs和EMT。

5.1 靶向BCSC标志物治疗肿瘤

靶向CSC标志物的治疗方法是通过单克隆抗体特异识别和结合CSCs表面标志物，衍生出的单抗药物、抗体偶联药物、纳米微粒药物等等。在侵袭性乳腺癌中，抗人CD44单克隆抗体与阿霉素和环磷酰胺联合使用纳米粒子已被用于预防肿瘤复发[194]，乳腺癌干细胞纳米颗粒介导的治疗也有助于化疗药物、RNAi或抗体对干细胞群体的特异性传递。

5.2 靶向EMT和BCSC相关异常信号通路治疗肿瘤

前面已经提到有大量研究表明EMT刺激细胞干性的获得受到多个信号通路的调节，靶向信号通路治疗通常采用的方法是阻断BCSCs异常表达的信号通路，包括Wnt、Notch、Hh、NF-κB、JAK/STAT、TGF-β/Smad、STAT3等通路，是目前开发中最庞大的一类靶向BCSCs的药物。例如γ分泌酶抑制剂(GSIs)可以有效阻断Notch信号通路，一项I/II期临床试验表明，GSI MK-0752联合多西他赛显著减少了CD44+/CD24-干细胞和ALDH+干细胞的数量，并降低了乳腺肿瘤中的乳腺球形成效率[195]。在体外和异种移植模型[196]中，使用Wnt信号抑制剂治疗也已证实可抑制BCSCs的生长。托珠单抗可抑制IL-6/STAT3信号转导，抑制TNBC细胞的增殖能力、迁移、侵袭能力以及EMT过程，还可以通过抑制Wnt/β-catenin乳腺癌干细胞相关通路抑制干性[134]。此外，有许多潜在的TGF-β调节剂/抑制剂如咪喹莫特[197]、贝伐珠单抗[198]都已经在临床试验中积极介入治疗乳腺癌患者，未来的转化研究将TGF-β抑制剂联合其他抑制剂和化疗药物更好的靶向BCSCs，提高抑制肿瘤致瘤性和转移的能力。

5.3 靶向表观遗传修饰药物

乳腺CSCs对表观遗传修饰具有本质敏感性，因此可以受到基于表观遗传学的治疗的显著影响。DNA高甲基化抑制剂地西他滨(DAC)可通过恢复肿瘤抑制基因正常的去甲基状态而达到治疗乳腺癌的目的[199]，用纳米颗粒负载低剂量的DAC(NPDAC)和阿霉素(NPDOX)可以显著下调DNMT1和DNMT3B的表达，ALDH CSC比例显著降低，并能较好地克服耐药[200]。此外，DNMT抑制剂5-氮杂苷和HDAC抑制剂丁酸盐的组合也可以显著降低BCSCs的丰度，增加小鼠总生存率[201]。DNMTi和HDACi还可以通过表观遗传重编程EMT，同时靶向多个通路，具有较好的抗肿瘤作用。

5.4 靶向肿瘤微环境的乳腺癌治疗

肿瘤微环境涉及的因素也调节着BCSCs的异质性和可塑性，进而影响治疗耐药。BCSCs的微环境中的各种细胞，包括免疫细胞、脂肪细胞、间充质干细胞、内皮细胞和成纤维细胞经旁分泌途径通过细胞因子网络与BCSCs相互作用。通过肿瘤相关巨噬细胞CSF1R的靶向抑制，可抑制TAMs活性并增强CD8+T细胞的浸润。临床上也正在尝试将CSF1R小分子抑制剂和PD-1抑制剂联合治疗乳腺癌，希望协同促进肿瘤中T细胞、B细胞和NK细胞的浸润增加，达到抑制肿瘤生长甚至防止远处复发的目的[202]。由免疫细胞分泌的细胞因子，如IL-6、IL-8和CXCR1，已被证明在体外和异种移植模型中调节BCSCs的活性[203]。有报道指出，针对小分子CXCR1/CXCR2抑制剂repertaxin的抗体可以靶向异种移植模型中的BCSCs，从而抑制肿瘤的生长和转移[204]。多种中药复方或中药提取物也被证明具有强大的临床开发潜力，可以用于乳腺癌的治疗以阻止乳腺癌转移复发。比如天然复方大黄素可以通过阻断TGF-β1介导的TAMs与乳腺癌细胞间的串扰，抑制乳腺癌细胞EMT和CSC的形成[142]。

5.5 靶向BCSC的免疫疗法

基于免疫治疗的抗BCSCs方法也受到了广泛的研究关注，考虑到共抑制分子和免疫检查点配体，如程序性死亡配体(PD-L1)在各种癌症的CSCs上高度表达，许多研究小组也评估了针对BCSCs的免疫治疗方法。在人类乳腺上皮细胞中诱导EMT会导致PD-L1表达上调，这主要依赖于PI3K/AKT通路的激活，并且在PD-L1表达和已知具有高EMT评分的Claudin-low乳腺癌亚群之间显示出强关联(P<0.000 1)[205]。与此同时，最近的一份报告还显示，在乳腺癌中PD-L1表达和干细胞评分之间存在统计学上显著的相关性(P<0.000 1)，PD-L1表达激活了干细胞相关基因OCT4、NANOG和Bim1的表达，并且是AKT途径依赖的[206]。肿瘤干细胞中丰富的PD-L1表达有助于CSCs的免疫逃避，提示PD-L1可能在EMT和BCSCs相互关系中起到重要作用。上皮-间充质转化通过EMT/β-catenin/STT3/PD-L1信号轴，在转录水平上通过β-catenin诱导N糖基转移酶STT3，随后依赖STT3的PD-L1 N糖基化稳定和上调PD-L1，从而丰富了CSCs中的PD-L1[207]。通过糖基化调控将MET与PD-L1的稳定联系起来，并揭示了MET作为一种潜在的策略来提高癌症免疫治疗的疗效。同时，基于抗体的检查点阻断疗法可以通过破坏表达PD-L1的肿瘤细胞和表达PD-1的细胞毒性T细胞之间的相互作用来对抗肿瘤细胞，这重新点燃了沉默的宿主抗肿瘤免疫力，以消除癌细胞。

5.6 靶向代谢治疗

BCSCs具有显著不同的代谢特征，目前针对BCSCs的糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢和氧化还原代谢均开发了一系列的潜在治疗药物。BCSCs的可塑性使其能够在增殖的E状态和侵袭性的M状态之间过渡，而M-和E-BCSCs依赖于不同的代谢途径，对糖酵解和氧化还原代谢抑制剂表现出明显不同的敏感性。Luo等[208]报道可以通过调节氧化还原信号来靶向乳腺癌干细胞的状态平衡，糖酵解和TXN/GSH通路的共同抑制通过消除M-和E-BCSCs抑制肿瘤生长、肿瘤起始潜能和转移，利用不同BCSCs状态的代谢脆弱性提供了一种针对这一关键肿瘤细胞群的新的治疗方法。

5.7 其他靶向治疗方法

除了上述靶向BCSCs的治疗策略外，还提出了一些其他的治疗策略，如天然化合物提取物、miRNA抑制相关癌基因、二甲双胍治疗、纳米颗粒靶向治疗、透明质酸缀合包裹策略等等。利用纳米颗粒靶向miRNAs并将siRNA传递到肿瘤是逆转耐药和提高疗效的有效策略，如miR-124通过靶向STAT3控制HIF-1信号通路，逆转BCSCs对阿霉素的耐药[209]。低剂量的二甲双胍可以选择性杀死BCSCs，采用透明质酸植入二甲双胍负载氧化石墨烯(HA-GO-Met)纳米颗粒更好的提高抗癌效果[210]。透明质酸缀合包裹化疗药吉西他滨形成的脂质体复合物也可以通过稳定吉西他滨并增强其对BCSCs的靶向识别来特异性地杀伤乳腺癌干细胞，以达到对乳腺癌精准治疗的目的。

6 总结和展望

大量研究证实了干性和EMT的关系的确是错综复杂的：EMT和干性存在高度相关性,大量研究显示经历EMT的细胞具有干细胞特性，具有干性的肿瘤细胞也表达EMT标记;乳腺癌干细胞具有高度异质性和可塑性，赋予癌细胞在不同状态之间动态转化的能力,乳腺癌干细胞同时受益于这两种特性提供的优势，表现出更高的转移能力和抵抗不同治疗方式的能力;在肿瘤细胞中诱导EMT不仅促进干性，肿瘤细胞侵袭和转移，而且还有助于耐药性，BCSCs成为促进EMT过程的主要参与者;EMT通过改变乳腺癌细胞的基因表达谱，调控与干性相关基因的表达，从而促进乳腺癌复发、转移和耐药;TGF-β、Wnt、Notch、Hippo、NF-κB、Hh和IL-6/STAT3等多条信号转导通路通过调控大量转录因子、表观因子调节调控EMT和干性;肿瘤微环境中包含的免疫细胞、基质细胞、细胞因子和生长因子、细胞外基质等多种因素以及存在的显著低氧、酸性等生理特点也可以调节EMT、MET、肿瘤干细胞的产生，从而影响肿瘤组织的恶性进展。

但是，EMT和干性的本质联系是什么？EMT是否一定增加干性？干性增加是否一定促进EMT？部分EMT是如何被调控的？EMT诱导的乳腺癌干细胞形成机制在多大程度上可推广到其他组织和肿瘤类型？靶向EMT和干性的药物还没有真正上市等等一系列问题仍然悬而未决。

鉴定出调控乳腺癌干细胞EMT的关键环境因子、信号通路、转录因子和表观因子；阐明正常生理及病理条件下EMT/MET调控乳腺发育和乳腺癌发生发展过程中干细胞的功能及其分子机制，为乳腺癌防治提供新的靶点和策略；将生物信息学和组学研究结合，基于“疾病-基因-靶点-药物”的策略，探寻靶向BCSCs的小分子药物，这些都是未来将要努力的方向。此外，对乳腺癌干细胞和上皮间质转化的进一步研究需要利用更多的技术进行可视化，更好地表征他们的表型，利用强有力的生物标记物以及基因和信号通路，确定新的治疗方法及潜在靶点，以防止转移和复发，并改善临床结果。

致谢本论文得到国家科技部重点研发计划项目(2020YFA0112300)、国家自然科学基金 (81830087, U2102203, 82173014)和云南省科技厅重点项目(202101AS070050)资助。