1株野生灵芝的分离鉴定及生物学特性分析*

刘冬梅，孙雪言，严碧云，陈泽群，刁文彤，梁呈元**

（1.江苏省中国科学院 植物研究所，江苏 南京 210014；2.武汉工程大学，湖北 武汉 430205；3.武昌工学院，湖北 武汉 430065）

灵芝（Ganoderma lucidum）俗称“赤芝”，为多孔菌科（Polyporaceae） 灵芝属（Ganoderma） 真菌。灵芝作为我国重要的传统中药，始载于最早的药物学专著《神农本草经》，具有扶正固本、延年益寿之功效，被归为上品；如今被《中华人民共和国药典》收载，是法定的中药药材[1]。研究发现，灵芝富含三萜、多糖等多种活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、保护神经、改善肝功能、抗氧化、抗病毒等广泛药理作用，临床上常用于辅助治疗慢性支气管炎、消化不良、神经衰弱、高血压、高血糖、肝炎和癌症等[2-4]。近年来，随着人们保健意识的增强，灵芝产品的开发越来越受到重视。目前，我国灵芝主栽品种大多引自国外，易出现菌种活性退化、子实体品质难以控制等问题[5]。因此在保护生态环境的前提下，充分发掘野生资源、丰富灵芝菌种资源仍是一项重要的工作。

通过对1株采集自南京紫金山的野生菌株子实体进行组织分离、菌丝纯化，得到菌株ZJ-1，并以形态学观察和ITS序列分析相结合的方法进行品种鉴定。同时开展菌株ZJ-1的生物学特性、驯化栽培及孢子观察等试验，以期为紫金山野生资源开发提供参考，为开展灵芝子实体发育、孢子形成等机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

野生菌株的子实体，采自江苏省南京市紫金山的一片落叶地。挑选尚未木质化、无破损的子实体，用袋子装好带回实验室。

1.1.2 培养基及培养料

PDB培养基：取去皮马铃薯200 g，均匀切片后于锅中煮沸20 min，滤网过滤除渣，加入葡萄糖20 g，加水定容至1 L，121℃高压灭菌20 min。

PDA培养基：1 L的PDB中加入琼脂15 g。

基础培养基：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、琼脂15 g，加水定容至1 L，121℃高压灭菌20 min。

栽培培养料（配比以质量分数表示）：木屑20%、棉籽壳58%、麸皮20%、蔗糖1%、石膏1%，含水量为60%左右，121℃高压灭菌180 min。

1.1.3 主要仪器及试剂

主要仪器：GI54DS高压蒸汽灭菌锅，致微仪器有限公司；SW-CJ-1F超净工作台，苏净安泰设备有限公司；DNP-9082恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；ETC821 PCR扩增仪，南京乔贝琳生物科技有限公司；JY300C电泳仪、JY04S-3E凝胶成像系统，北京君意东方电泳设备有限公司；QUANTA 200扫描电子显微镜，美国FEI公司。

主要试剂：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）和引物合成，上海生工生物工程有限公司；高保真酶、TA克隆试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公司；感受态细胞DH5α、PCR产物纯化试剂盒，南京擎科生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种的分离与纯化

用水冲洗菌株幼嫩子实体表面的泥土，去掉菌柄后用75%乙醇进行表面消毒，用无菌解剖刀自菌柄处切开少许，然后将子实体掰开。在菌盖及菌盖与菌柄交界处切取米粒大小的组织放在PDA平板培养基上，用封口膜封口后于28℃培养箱培养。每天观察菌丝生长情况，将未污染的菌丝转接到PDA斜面培养基上，4℃保藏。

1.2.2 菌种的鉴定

1） 形态学特征

用无菌打孔器在生长着新鲜菌丝的PDA平板培养基上打孔，接种于新的PDA平板培养基中央，置于28℃培养箱培养1周，观察菌丝的生长情况。将灭菌后的盖玻片斜插入含有菌丝的PDA平板培养基中，待菌丝生长至盖玻片上后观察菌丝的显微结构。

2）ITS序列扩增与测序

采用CTAB法提取灵芝菌丝的基因组DNA[6]。以提取的DNA为模板，使用真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）进行PCR扩增。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将片段大小正确的PCR产物纯化后连接T载体，转化到大肠杆菌DH5α中。挑取单克隆，经PCR检测后送到上海生工生物工程有限公司测序。

3）系统发育树的构建

所得ITS序列在NCBI数据库中进行同源比对，以硬毛革孔菌（Coriolopsis caperata） 为外群[7]，用MEGA 5.0软件采用邻接法NJ（neighbor-joining method）构建系统发育树，Bootstrap参数设定为1 000。

1.2.3 菌丝培养特性研究

1） 温度对菌丝生长的影响

在直径为5.5 cm的PDA平板培养基上用打孔器接种直径为7 mm的菌丝块，分别于20℃、25℃、28℃、32℃和37℃避光培养，每个处理设置3个重复。当有一组菌丝长满平板时，采用“十”字交叉法测量全部供试菌落直径，并记录菌丝生长情况[8]。

2）pH对菌丝生长的影响

用0.1 mol·L-1的HCl和NaOH调节PDA培养基的pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。接种、培养及测量方法同上。

3）碳源对菌丝生长的影响

以不加葡萄糖的基础培养基为对照（CK），配制分别以葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘油作为碳源的培养基。接种、培养及测量方法同上。

4）氮源对菌丝生长的影响

以不加蛋白胨的基础培养基为对照（CK），配制分别以蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、氯化铵、尿素和麸皮作为氮源的培养基。接种、培养及测量方法同上。

1.2.4 出菇试验

为了检测菌种纯度及验证分离的菌丝是否具有出菇能力，选用袋料栽培的方法进行出菇试验。每个菌袋装湿料约800 g，在培养料中间插入一个长度为16 cm的打孔棒，封口后于121℃条件下高压灭菌3 h，冷却至室温后于无菌超净台取出打孔棒，将准备好的母种填满孔洞，完成接种。将菌袋置于28℃避光培养。

1.2.5 菌管的显微观察

待子实体成熟后，纵切其菌管部位，用炭膜将切片粘在扫描电镜的样品台上，喷上一薄层导电金，用扫描电镜观察。

1.2.6 数据处理与统计分析

采用Excel 2013软件进行基础数据处理，结果用平均值±标准差表示。通过SPSS 16软件进行统计分析，检测其差异显著性（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 野生子实体形态特征

在南京市紫金山的一片落叶地采集到的野生子实体的形态见图1。

图1 野生菌株子实体形态Fig.1 The fruiting bodies morphology of wild strains

如图1所示，幼小子实体边缘呈黄白色，较嫩；成熟子实体较小，菌盖呈肾型，表面红褐色，有似漆样光泽；有菌柄，菌柄侧生且较短。通过形态学观察发现，采集到的野生子实体符合典型灵芝的形态特征。

2.2 分离纯化后菌丝的形态特征

对野生菌株进行组织分离培养，组织块在PDA平板培养基中培养2 d～3 d，菌盖及菌盖与菌柄交界处的组织块均有少量白色棉絮状菌丝长出，将其命名为ZJ-1。菌株ZJ-1的菌丝生长1周时的观察结果见图2A。挑取组织块边缘的菌丝接种到直径为9.0 cm的PDA平板培养基上，大约7 d可长满，得到纯化后的菌株ZJ-1，其菌丝生长情况及菌落形态见图2B，菌丝形态观察见图2C。

图2 组织分离培养（A） 以及纯化菌株ZJ-1的菌落（B）、菌丝（C） 形态观察Fig.2 Tissue isolation culture(A),colony(B)and mycelia(C)morphology observation of purified strain ZJ-1

如图2所示，纯化菌株ZJ-1的菌落呈规则圆形，边缘整齐，无分泌物；菌丝洁白纯净，浓密，颜色一致。微观形态显示，菌株ZJ-1的菌丝细长，粗细均匀，有分枝，且具有锁状联合结构（图2C箭头指示位置）。

2.3 菌株ZJ-1的ITS序列分析

经PCR扩增和测序分析，获得长度为636 bp的ITS序列，将ITS序列提交至GenBank数据库，获得登录号MW362341。根据BLAST比对结果并结合文献报道，以硬毛革孔孔菌Coriolopsis caperata为外群，选择灵芝属不同真菌的ITS序列构建系统发育树[7]，详见图3。

图3 基于ITS序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由图3可知，菌株ZJ-1在系统发育树上与Ganoderma lucidum聚为一支，支持率为100%。结合形态学特征，将菌株ZJ-1鉴定为灵芝Ganoderma lucidum。

2.4 菌丝培养特性研究

2.4.1 温度对菌丝生长的影响

5个不同温度条件下灵芝菌株ZJ-1的菌丝生长情况见表1。

表1 温度对灵芝菌株ZJ-1菌丝生长的影响Tab.1 Effect of temperature on mycelial growth of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

由表1可知，灵芝菌株ZJ-1在20℃～37℃的培养条件下均可生长；温度为20℃、25℃和37℃时生长较慢，但生长速度差异不显著；温度为28℃、32℃时生长速度最快，菌丝最浓密，生长速度差异也不显著。综合菌丝的生长速度和长势，确定灵芝菌株ZJ-1菌丝生长最适温度为28℃～32℃。

2.4.2 pH对菌丝生长的影响

6个不同pH条件下灵芝菌株ZJ-1的菌丝生长情况见表2。

由表2可知，灵芝菌株ZJ-1在pH为4.0～9.0的培养基中均能生长，且pH为4.0～7.0时菌丝长势均较好。其中，培养基pH为4.0和5.0时，菌丝生长最好；pH为6.0和7.0时，菌丝生长速度略有减慢；当pH高于7.0时，菌丝生长速度明显变慢。综合菌丝的生长速度和长势，确定灵芝菌株ZJ-1菌丝生长的最适pH为4.0～5.0。

表2 pH对灵芝菌株ZJ-1菌丝生长的影响Tab.2 Effect of pH on mycelial growth of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

2.4.3 碳源对菌丝生长的影响

8种不同碳源培养基中灵芝菌株ZJ-1的菌丝生长情况见表3。

表3 碳源对灵芝菌株ZJ-1菌丝生长的影响Tab.3 Effect of carbon source on mycelial growth of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

由表3可知，灵芝菌株ZJ-1在添加不同碳源的培养基中均可生长，但菌丝对碳源的利用能力不同。以可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖为碳源时菌丝生长最快；其次为果糖和葡萄糖；最慢的为乳糖。对照组中菌丝也能生长，但菌丝长势较弱。以乳糖为碳源时，菌丝生长速度与无碳源对照组相比差异不显著，但菌丝比对照组更洁白、致密，说明碳源是菌丝生长的重要营养成分。综合菌丝的生长速度和长势，确定灵芝菌株ZJ-1的菌丝生长最适碳源为可溶性淀粉。

2.4.4 氮源对菌丝生长的影响

不同氮源培养基中灵芝菌株ZJ-1的菌丝生长情况见表4。

表4 氮源对灵芝菌株ZJ-1菌丝生长的影响Tab.4 Effect of nitrogen source on mycelial growth of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

由表4可知，灵芝菌株ZJ-1在以酵母粉、麸皮为氮源的培养基上生长速度最快，但以麸皮为氮源时，菌丝长势弱；其次为牛肉膏和蛋白胨；以氯化铵和尿素为氮源时，菌丝几乎不生长或略有生长；无氮源对照组（CK）菌丝不生长。综合菌丝的生长速度和长势，确定灵芝菌株ZJ-1的最适氮源为酵母粉。

2.5 出菇试验结果

对灵芝菌株ZJ-1进行出菇试验，子实体发育过程中的形态变化及特点详见图4。

如图4所示，灵芝菌株ZJ-1在栽培培养料中生长较快，28℃时菌丝长满菌袋约需20 d。菌丝满袋后，在菌袋上部开口，移入具有散射光的菇房中。袋口的菌丝开始扭结，大约7 d形成原基。条件适宜时，原基进一步分化形成子实体，待灵芝子实体成熟时，便从子实体腹面的菌管（图4D箭头指示位置）处喷射孢子。

图4 灵芝菌株ZJ-1的子实体形态变化及特点Fig.4 Morphological changes and characteristics of fruit bodies of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

2.6 扫描电镜显微观察

利用扫描电镜观察成熟灵芝子实体的菌管结构及孢子，详见图5。

图5 灵芝菌株ZJ-1的显微观察Fig.5 Microscopic observation of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

由图5A可看出，灵芝菌管内具有规则的网状结构，其上布满孢子。由图5B可看出，灵芝孢子个体非常小，约为7.0 μm×4.2 μm；在电子显微镜下将其放大5 000倍时，可见其个体呈卵形，外壁平滑，表面布满小孔，顶端平截。

3 讨论

生产实践经验证明，大多引自国外的灵芝主栽品种易出现菌种活性退化、子实体品质难以控制等问题[5]。在生态环境保护的前提下，鉴定和驯化了南京市紫金山野生灵芝菌株，可为开发当地灵芝种质资源奠定基础。

野生大型真菌的鉴定方法主要有经典分类鉴定方法和分子水平鉴定方法。经典分类鉴定方法主要为观察菌丝和子实体的形态，是最基本且不可替代的方法，但由于野生子实体分布广泛，容易受到外界环境的影响而出现形态不稳定的情况，因此还需借助分子水平鉴定方法进行确认[9]。本次试验中除了观察菌丝和子实体的形态，还结合ITS序列分析法鉴定菌株ZJ-1的分类地位，通过BLAST比对及系统发育分析，将菌株ZJ-1鉴定为灵芝Ganoderma lucidum。

王庆武等[10]发现泰山灵芝4914的适宜生长温度为25℃～30℃，适宜pH为6.0～7.0，最适碳源为蔗糖，最适氮源为酵母膏。马博等[7]发现有柄灵芝（Ganoderma gibbosum） BSU01的最适生长温度为30℃，最适pH为5.5，最适碳源为果糖或葡萄糖，最适氮源为酵母提取物。努尔阿丽耶·阿卜力米提等[11]报道的新疆灵芝菌株XJ-001最适碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母粉。蒋帅等[12]报道的韦伯灵芝（Ganoderma weberianum） 适宜生长温度为28℃～32℃，适宜pH为6.0，最适碳源为糊精，最适氮源为酵母粉。而此次试验结果表明，灵芝菌株ZJ-1的最适温度为28℃～32℃，与韦伯灵芝一致；适宜pH为4.0～5.0，与上述4种菌株相比偏酸性；最适碳源为可溶性淀粉，不同于上述菌株；最适氮源为酵母粉，与泰山灵芝4914、有柄灵芝BSU01和新疆灵芝XJ-001均一致。灵芝菌株ZJ-1的生物学特性与其他报道的研究结果既有一致性，又存在差异，可能是供试菌株来源不同及基础培养基的成分不同所致。与野生子实体相比，驯化栽培后的子实体菌盖厚实，并且能产生大量孢子。经电镜观察发现菌管表面布满孢子；孢子个体呈卵形，外壁平滑，表面布满小孔，顶端平截。灵芝孢子因具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等药理作用，近年来其相关产品亦备受消费者青睐，可加以开发[13]。

上述研究结果可为紫金山野生灵芝资源开发提供参考，为开展灵芝子实体发育、孢子形成的机制研究奠定基础。