枯草芽孢杆菌PS-8对桔梗连作障碍土壤的修复及其促生作用

冀玉良，赵志新，高宝云

（商洛学院 生物医药与食品工程学院/商洛市秦岭植物良种繁育中心，陕西商洛 726000）

随着中药材需求量不断上升，仅靠自然生长的中药材资源已不能满足人们需要，为了解决中药材供需矛盾，当前对中药材普遍进行人工栽培。但是人工栽培中药材一直面临着容易导致土壤有害微生物富集、病虫害发生加剧、植物自毒物质积累和土壤肥力下降等连作障碍问题[1-3]。近十几年来，在克服连作障碍研究方面，基于微生物菌剂或有机肥的土壤改良方法倍受人们重视[4-7]。由于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有典型的芽孢杆菌的特征，并具有生长迅速、抗逆性强、适应范围广等优点，它不仅能分泌多种抗菌物质，对各种病原菌，特别是对引起植物根腐病、枯萎病等病害的尖孢镰刀菌有较好的抑制作用，而且还具有较强的解磷、分泌植物生长素能力，对作物生长有一定的促进作用，因此枯草芽孢杆菌在连作障碍土壤改良修复中具有较大的优势和开发潜力[8-10]。诸多研究表明，枯草芽孢杆菌对设施蔬菜连作障碍土壤的修复作用是通过降低连作障碍土壤中的植物病原菌——尖孢镰刀菌的数量，提高土壤中细菌和放线菌的数量，降低总真菌的数量，调整土壤的微生物区系结构和土壤中蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶等的活性来实现的[11-13]。向黄瓜、西瓜和猕猴桃连作障碍土壤中施入不同剂量的枯草芽孢杆菌可缓解协迫条件下幼苗受到的伤害，提高果实的品质[14-16]。枯草芽孢杆菌对玉米、小麦和大豆等粮食作物连作中的促生作用也主要是通过提高其组织中过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性，降低丙二醛（MDA）含量，提高作物对土传病原菌的抵抗能力和各种抗胁迫能力，使其免受侵害[17-19]。

枯草芽孢杆菌PS-8是本课题组从桔梗组织中分离获得的一株内生菌，前期抑菌试验研究表明，枯草芽孢杆菌PS-8对烟草赤星病菌、苹果炭疽病菌、茄病镰孢霉和西瓜枯萎病菌等均有一定的抑制作用。本研究采用室内盆栽法向桔梗连作土壤中添加不同比例的枯草芽孢杆菌PS-8菌剂，分析其对土壤微生物群落、土壤酶活性的影响，以及对桔梗幼苗的促生作用，进一步探明用枯草芽孢杆菌PS-8制作桔梗连作障碍土壤改良剂的可行性，为其应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

枯草芽孢杆菌PS-8（从商州区沙河子镇农户桔梗种植地采集的桔梗植株组织中分离，通过革兰氏染色和分子测序比对等鉴定其为枯草芽孢杆菌，保存于商洛学院生物医药与食品工程学院微生物学实验室）、尖孢镰刀菌（购于中国工业微生物菌种保藏管理中心）、桔梗种子（由陕西天士力植物药业商洛有限责任公司提供）、供试土壤（桔梗连作多年的土壤，采自商州区沙河子镇农户桔梗种植地）。

1.2 培养基

细菌用牛肉膏蛋白胨培养基、LB液体培养基培养；真菌用马丁培养基培养；放线菌用高氏1号培养基培养。以上培养基配方参考文献[20]。

尖孢镰刀菌用改良的KOM-ADA选择培养基：K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，EDTA（C10H16N2O8）100 mg，L-天门冬酰胺 2 g，D-半乳糖10 g，琼脂16 g，灭菌水900 mL，120 ℃灭菌 15 min。

培养基冷却到50℃时添加以下培养液：Na2B4O71 g，PCNB（五氯硝基苯） 1 g，牛胆盐500 mg，链霉素 300 mg，氯霉素 100 mg，10%磷酸调节至pH为4。

1.3 方法

1.3.1 枯草芽孢杆菌PS-8活化与菌剂制备

枯草芽孢杆菌PS-8接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上活化24 h后，转接入LB液体培养基，于 220 r/min，30 ℃下培养 35～40 h，显微镜检有90%形成芽孢时收集菌液，经10 000 r/min离心浓缩，用血细胞计数板计数，将浓缩液稀释成2×108cfu/mL的接种菌液，保存于4℃冰箱，备用。

1.3.2 桔梗催芽与移栽

选取大小均匀、健康的桔梗种子，用3%KMnO4浸泡30 min，蒸馏水冲洗6次，自然晾干。在洗净烘干的直径9 cm的培养皿中铺上双层滤纸，加入10 mL蒸馏水浸湿滤纸后，将桔梗种子置于其上，每皿50粒，放入25℃，85.5%湿度人工气候箱中培养,每天补加蒸馏水保持滤纸湿润。待桔梗幼苗生长至大约2 cm时，选用长势一致的桔梗种苗，移栽至装有桔梗连作土壤，直径15 cm、高15 cm的塑料小盆中。每盆装土500 g，设4个处理，各处理按重量比分别往土壤中加入1%，2%，3%，4%的枯草芽孢杆菌PS-8菌剂并与土壤充分混合，以蒸馏水代替菌剂作对照（CK），每处理3盆，重复4组共60盆。移栽好的桔梗盆栽苗移至人工气候室,按常规进行生长管理。

1.3.3 土壤微生物数量测定

分别于桔梗盆栽苗生长14，28，42，56 d时，按对角线五点法从每个塑料盆中选5个采样点，在表层下5 cm取土壤样品并混匀，去除杂质，用四分法留取土样，土样于遮光、低温下放置，并及时测定土壤中尖孢镰刀菌、细菌、放线菌和总真菌（总真菌中包括尖孢镰刀菌）数量。

土壤微生物数量测定采用稀释涂布平板法，参考文献[11,20]的方法。尖孢镰刀菌计数吸取10-2土壤稀释液，对应涂布于改良的 Komada选择性培养基；细菌计数吸取10-6土壤稀释液，对应涂布于牛肉膏蛋白胨培养基（为抑制霉菌生长其中加入终浓度为5 μg/mL的制霉菌素溶液）；总真菌计数时吸取10-3土壤稀释液，对应涂布于马丁氏孟加拉红选择性培养基（为抑制细菌和放线菌的生长，在1 000 mL培养基中加入1%孟加拉红3.3 mL，链霉素加热易分解，临用前按每100 mL培养基中加入1%链霉素0.3 mL）；放线菌计数吸取10-4土壤稀释液，对应涂布于高氏培养基。

1.3.4 土壤酶活性测定

土壤酶活性测定参考文献[12-14]的方法。过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定，结果以每克土消耗0.1 mol/L KMnO4的毫升数表示（mL/g）；土壤脲酶活性采用靛酚蓝比色法测定，以每克土24h产生的NH3-N毫克数表示（mg/g）；蔗糖酶活性采用二硝基水杨酸比色法测定，以每克土24 h产生的葡萄糖毫克数表示；磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定，以每克土24 h产生的酚毫克数表示。所有测定重复3次取平均。

1.3.5 桔梗叶片MDA含量测定

分别于桔梗盆栽苗生长 14，28，42，56 d 时进行植株叶片取样（56 d时等桔梗幼苗株高、鲜重测定后再取样），每处理从上往下数取5片叶片，叶片冲洗干净，晾干称重后用研钵冰浴研磨，用于测定MDA含量。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法,利用MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸（TBA）反应，生成的有色三甲基复合物在波长532 nm处有最大光吸收来测定，含量以每克叶片含MDA的μmol数表示，测3次取平均值。

1.3.6 桔梗生长量测定

分别于桔梗盆栽苗生长14，28，42，56 d时用米尺测株高，并于桔梗盆栽苗生长56 d时，进行破坏性取样，小心从花盆中取出植株，轻轻抖去土粒，清水冲洗净并用吸水纸吸干水分，分别用米尺和百分天平测定桔梗幼苗株高和鲜重。

1.3.7 统计分析

数据统计分析使用SPSS 17.0统计软件，各处理间的差异显著性检验采用Duncan's多重比较法。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌PS-8对桔梗根际土壤尖孢镰刀菌数量的影响

桔梗种植多年后的土壤中引起根腐病的尖孢镰刀菌数量会大量增加，进一步导致连作障碍。由图1可知，在施入枯草芽孢杆菌PS-8前测得土壤中尖孢镰刀菌数量为16.74×102cfu/g，施入枯草芽孢杆菌后14，28，42，56 d时各处理的尖孢镰刀菌数量都明显低于施入前的数量，其中至28 d时，1%，2%，3%，4%各菌剂处理的尖孢镰刀菌数量分别为 10.16×105，4.28×102， 8.61×102，10.37×102cfu/g，与施入前相比分别下降了39.31%，74.43%，48.57%，38.05%，可见2%菌剂处理在28 d时下降最多。在同一时期，各处理的尖孢镰刀菌数量与对照之间达到极显著差异（P<0.01），其中2%菌剂处理的尖孢镰刀菌数量最低，且与同期1%，3%，4%各菌剂处理之间相比差异也达到显著水平（P<0.05）。另外，从图1中也可以看出，从0～14 d，对照土壤中尖孢镰刀菌数量上升，随后开始有所下降，这与徐彬等[11]用枯草芽孢杆菌1013对连作障碍土壤的改良及对番茄的促生作用的研究结果基本一致。分析原因可能是连作土壤中病原菌的繁殖也有周期性的阶段变化，过了高峰就会有所下降，但病原菌不会在土壤中自然消除，进入下一个繁殖周期又可能会到达一个高峰，而从枯草芽孢杆菌PS-8加入至14 d和28 d时土壤中尖孢镰刀菌数量与对照相比大幅下降的结果正好证明加入菌剂的生防效应是极显著的。

图1 枯草芽孢杆菌PS-8对桔梗根际土壤尖孢镰刀菌数量的影响

2.2 枯草芽孢杆菌PS-8对桔梗根际细菌数量的影响

桔梗连作多年土壤中微生态结构发生失调，也表现为细菌数量减少，真菌数量增加，结果导致土壤的营养下降和病虫害更易发生。在施入枯草芽孢杆菌PS-8前测得桔梗连作土壤中细菌数量为53.62×106cfu/g，由图2可知，随着时间的延长，对照土壤中的细菌数量一直呈现下降趋势，这正是桔梗连作土壤中微生态失调，引起细菌数量减少的表现。接入枯草芽孢杆菌PS-8后0～14 d，各处理土壤的细菌数量也有所减少，这可能是枯草芽孢杆菌开始在土壤中要经过一个调整适应阶段。但从14 d以后各处理土壤的细菌数量就开始上升，至24，42，56 d时，1%，2%，3%，4%各菌剂量处理的土壤细菌数量均大于同期对照，且与对照差异达到极显著水平（P<0.01），其中至28 d时，各处理的细菌到达最大，对应1%，2%，3%，4%各菌剂处理的土壤，细菌数量分别为 68.31×106，78.61×106，72.63×106，64.75×106cfu/g，与施入枯草芽孢杆菌PS-8前土壤相比，细菌数量增长率分别为27.40%，46.61%，35.45%，20.76%，不仅与同期对照（35.45×106cfu/g）相比均具有极显著差异，而且各处理之间也具有极显著差异（P<0.01），其中2%菌剂处理对桔梗连作障碍土壤细菌数量的调整最为显著。至42 d和56 d时，各处理土壤的细菌数量虽然有所减少，但减少较缓慢，且各处理细菌数量仍极显著高于对照。42 d以后细菌数量减少的现象说明外加菌剂施入土壤中也有一个周期性的变化，并且要受到土著微生物和病原菌的抵抗，这启示人们在实际生产中，为了加强生态调节剂的效果，应适时进行补施。

图2 枯草芽孢杆菌PS-8对桔梗根际土壤细菌数量的影响

2.3 枯草芽孢杆菌PS-8对桔梗根际土壤放线菌数量的影响

枯草芽孢杆菌PS-8菌剂的施入对土壤放线菌数量的影响与对细菌数量影响基本相似。由图3可知，施加菌剂前测得土壤防线菌数量为21.51×104cfu/g，随着时间的延长，对照土壤中的放线菌数量一直呈现下降趋势，这正是桔梗连作土壤中微生态失调，引起放线菌数量减少的表现。施入枯草芽孢杆菌菌剂后各处理土壤的放线菌数量均呈现为先下降再上升，后又有所下降的趋势，至28 d时各处理土壤的放线菌数量达到最大，CK和1%，2%，3%，4%各菌剂处理土壤的放线菌数量分别为16.18×104和30.48×104，38.24×104，29.81×104，25.57×104cfu/g，相对于施入菌剂前的土壤放线菌数量，各处理土壤的放线菌数量增加率分别为88.38%，136.34%，84.24%，58.03%。其中2%菌剂处理土壤的放线菌数量最大，而且各处理与对照之间均具有显著差异（P<0.05），各处理除1%和3%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂处理之间无显著差异外，其余均具有显著性差异。至42 d和56 d时，各处理土壤的放线菌数量虽然有所减少，但减少较缓慢，且各处理土壤的放线菌数量仍极显著高于对照。放线菌是产生农用抗菌素的生防微生物，土壤中放线菌的增多有利于连作障碍土壤的修复。

图3 枯草芽孢杆菌PS-8对桔梗根际土壤放线菌数量的影响

2.4 枯草芽孢杆菌PS-8对桔梗根际土壤总真菌数量的影响

接种枯草芽孢杆菌菌后连作桔梗土壤中总真菌数量总体表现为明显下降的趋势。具体由图4可知，施入菌剂前测得桔梗土壤中总真菌数量为45.35×103cfu/g，施入枯草芽孢杆菌PS-8菌剂后，0～42 d对照的总真菌数量随着时间的延长一直在上升，42～56 d趋于稳定，而各处理总真菌数量均呈现出开始升高趋势，这可能是枯草芽孢杆菌PS-8菌剂施入后土壤微生态发生调整和适应的过程，而随后各处理总真菌数则明显下降，最终基本维持稳定的趋势。至28 d时，各处理土壤中的总真菌数降至最低，1%，2%，3%，4%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂各处理的真菌数量分别为41.73×103，24.29×103，33.28×103，37.38×103cfu/g，与接入菌剂前的土壤相比，分别下降了7.98%，46.44%，26.62%，17.57%，各处理与对照之间及各处理之间均具有显著差异（P<0.05），其中2%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂处理下降效果最为明显。至42 d和56 d时，各处理继续保持与对照之间具有显著性的差异。

图4 枯草芽孢杆菌PS-8对桔梗根际土壤真菌数量的影响

根据细菌数量随时间增加和总真菌数量随时间减少可进一步分析发现，桔梗连作土壤中接入枯草芽孢杆菌PS-8菌剂后，土壤中细菌和总真菌数量比值呈现明显上升的变化趋势，说明桔梗连作土壤微生物区系发生着由“以真菌为主”向“以细菌为主”的转化。

2.5 枯草芽孢杆菌PS-8对桔梗种植土壤酶活性的影响

植物在受到逆境胁迫情况下，组织细胞内会产生过氧化氢和其它一些过氧化物，这些氧化物会对植物产生损伤作用，影响植物生长。植物一般通过过氧化氢酶（S-CAT）和过氧化物酶来分解过氧化氢和其它过氧化物。S-CAT能催化过氧化氢分解为水和氧气，从而消除其对植物的损伤。作为对逆境胁迫的响应，植物在受到胁迫时体内S-CAT活性就会上升。从图5可知，在14，28，42，56 d 时，对照桔梗连作土壤中 S-CAT活性分别为 5.66，5.82，6.03，6.21 mL/g，表现出随着时间延长一直呈上升的趋势。而不同比例的枯草芽孢杆菌PS-8菌剂处理的土壤中过氧化氢酶（S-CAT）活性相对于接菌前土壤均明显降低，且显著低于同期对照（P<0.05），在28 d时，对照桔梗土壤中S-CAT活性为5.82 mL/g,各处理桔梗土壤中 S-CAT 活性分别为 5.36，4.26，5.05，5.18 mL/g,其中2%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂处理下降最多，与最初土壤S-CAT活性相比下降了21.55%，并显著低于CK。这说明枯草芽孢杆菌菌剂的施入使连作障碍土壤得到了修复，植物受到的胁迫得到了缓解，植物不需要产生大量的S-CAT作响应。

图5 枯草芽孢杆菌PS-8对土壤S-CAT活性的影响

从图6可以看出，施入枯草芽孢杆菌PS-8菌剂后土壤中脲酶（S-UE）活性变化与S-CAT相反，添加1%，2%，3%和4%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂的土壤中S-UE活性与对照相比显著增高（P<0.05），施入56 d时各处理S-UE酶活性分别为 9.14，10.48，9.83，9.36 mg/g，其中 2%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂处理的脲酶活性最大，高出同期CK 41.05%。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关，是土壤氮素状况和营养的表征指标，连作障碍土壤中施入枯草芽孢杆菌菌剂后脲酶活性增高，说明微生物代谢活动旺盛，可使土壤的氮素营养状况得到明显改善。

图6 枯草芽孢杆菌PS-8对土壤脲酶活性的影响

从图7可以看出，添加1%，2%，3%和4%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂的土壤中蔗糖酶活性显著高于同期对照（P＜0.05），施入56 d时各处理土壤蔗糖酶活性分别为 15.37，17.84，15.83，13.87 mg/g，其中2%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂处理效果最为明显，高出CK 34.64%。蔗糖酶又叫转化酶，它在土壤中能促进纤维素等糖类的分解，对增加土壤中易溶性营养物质起着重要作用。添加枯草芽孢杆菌的土壤中蔗糖酶活性增高，说明根际促生微生物代谢活性上升，使土壤的营养状况得到明显改善。

图7 枯草芽孢杆菌PS-8对土壤蔗糖酶活性的影响

从图8可知，添加1%，2%，3%和4%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂的土壤中磷酸酶活性显著高于同期对照（P<0.05），施入56 d时各处理土壤磷酸酶活性分别为 2.17，2.34，2.23，1.97 mg/g，其中2%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂处理效果最为明显，较CK高出了29.28%。土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化成无机磷的酶，土壤磷酸酶活性高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，这是因为通常土壤对外源无机磷素的利用率极低，施入土壤的无机磷肥大部分被土壤固定、吸附，但植物吸收不多。添加枯草芽孢杆菌的土壤中磷酸酶活性增高提高了植物对磷的利用，因而能提高土壤的肥力，减缓连作障碍，促进桔梗生长。

图8 枯草芽孢杆菌PS-8对土壤磷酸酶活性的影响

2.6 枯草芽孢杆菌PS-8对桔梗叶片MDA含量的影响

从图9可知，1%，2%，3%和4%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂分别处理桔梗叶片14 d时，各处理桔梗叶片MDA含量与对照之间无明显的差异。至28 d时，各处理桔梗叶片MDA含量下降，到达42 d时降至最低，1%，2%，3%和4%枯草芽孢杆菌PS-8各菌剂处理桔梗叶片MDA含量分别为 2.26，1.36，1.57，1.75 μmol/g，显著低于同期CK（P<0.05）,桔梗叶片MDA含量最低者为2%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂处理。至56 d时，各处理桔梗叶片MDA含量虽然有所上升，但也显著低于CK（P<0.05），其中2%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂处理最小，2%，3%和4%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂不同处理间桔梗叶片MDA含量没有显著差异。MDA是植物受到逆境胁迫后叶片细胞受损程度的反映，整个过程对照叶片MDA含量一直高于各处理，进一步证明了施入枯草芽孢杆菌菌剂后有效地减轻了连作障碍对桔梗生长带来的胁迫。

图9 枯草芽孢杆菌PS-8对桔梗叶片中MDA含量的影响

2.7 枯草芽孢杆菌PS-8对桔梗生长的影响

株高是反映植物生长的农艺指标，从图10可以看出，添加枯草芽孢杆菌PS-8菌剂对桔梗植株生长有明显的促进作用。在0～14 d内，各处理桔梗株高之间无显著差异，随着时间的延长，处理和对照之间株高差距在逐渐加大。至28 d时，与CK相比，1%，2%，3%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂各处理的桔梗株高分别高出对照29%，44.87%，15.28%，40.24%，26.79%，达到显著差异水平（P<0.05），2%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂处理对桔梗生长的促生作用最好，但4%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂处理对桔梗生长表现出有抑制作用，此后至42 d和56 d各处理基本上一直保持这种生长趋势。

图10 枯草芽孢杆菌PS-8对桔梗幼苗株高的影响

生物量是衡量植物在一定时间内物质累积量的指标，与植物的生长和光合作用密切相关。由图11可以看出，施入不同量的枯草芽孢杆菌PS-8菌剂对桔梗的地下和地上鲜重均有明显影响。与对照相比，施入2%枯草芽孢杆菌菌剂56 d后，桔梗植株地下部分增加了51.60%，地上部分增加了43.52%，均达到了显著水平（P<0.05），可见枯草芽孢杆菌PS-8菌剂能够减缓连作障碍，对桔梗生长有明显的促进作用。

图11 枯草芽孢杆菌PS-8对桔梗幼苗生物量的影响

3 讨论与结论

桔梗连作障碍是桔梗种植中面临的一大难题，导致连作障碍的根本原因在于连作土壤中微生态结构的失调，表现为细菌数量减少，真菌数量增加。同时微生态的失调又会进一步使土壤酶发生改变，这是因为土壤酶主要是土壤微生物产生的，土壤微生物结构与土壤中各种酶的含量与活力之间存在一定的相关性[21-23]。细菌和放线菌是土壤中无机物和有机腐植质的分解者，有利于土壤肥力的形成，而真菌增加更易使土壤中的植物病原菌繁殖，因此微生态的失调最终造成土壤营养和肥力下降，导致作物生长减慢和病虫害严重的连作障碍。

本研究通过向桔梗连作障碍土壤中添加枯草芽孢杆菌PS-8菌剂，发现施入不同量（1%，2%，3%和4%添加量）的枯草芽孢杆菌PS-8菌剂后，降低了土壤中植物病原菌——尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的数量，尤以2%枯草芽孢杆菌菌剂处理的效果最为显著。施入2%枯草芽孢杆菌菌剂到达28 d时，土壤中尖孢镰刀菌数量为4.28×105cfu/g，极显著低于同期对照21.46×105cfu/g（P<0.01）；接种枯草芽孢杆菌 PS-8 菌剂后，连作桔梗土壤中细菌和放线菌数量显著上升，而总真菌数量显著下降，桔梗连作土壤微生物群落结构发生了由以“真菌型为主”向“细菌型为主”的变化。细菌增多有利于土壤肥力提高，真菌的增加则容易使病原菌繁殖，因此，枯草芽孢杆菌PS-8菌剂提高了土壤中有益微生物的数量，桔梗连作土壤根际微生态环境发生了改善。

土壤酶在土壤养分循环中起着重要作用，其活性可作为衡量土壤微生物活性和土壤肥力的重要指标。本研究发现，添加枯草芽孢杆菌PS-8菌剂后，土壤酶的活性也向着有利于土壤肥力增加和连作障碍减轻的方向转变，表现为施入不同量的枯草芽孢杆菌PS-8菌剂处理后14，28，42，56 d，土壤中S-CAT活性显著低于同期对照，表明植物受到的土壤环境胁迫有所缓解。S-UE、蔗糖酶、磷酸酶活性显著高于同期对照，说明微生物代谢活性上升，土壤的营养状况得到改善。

MDA的产生是植物对逆境胁迫反应的产物，这是植物对胁迫作出的响应，反映了叶片受损伤的程度。本研究施入不同量的枯草芽孢杆菌PS-8菌剂后，桔梗叶片MDA含量均明显低于同期对照，其中2%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂处理桔梗叶片中MDA含量最低，与对照相比有显著差异（P<0.05）。MDA含量低说明连作土壤中施入菌剂后有效改善了土壤中的微生态环境，缓解了对桔梗生长的胁迫。

生物量是评价植株生长和健康状况最直观的指标之一。本研究进一步测定的农艺性状表明，枯草芽孢杆菌PS-8菌剂施入桔梗连作土壤后明显促进桔梗幼苗生长，2%枯草芽孢杆菌PS-8菌剂处理的桔梗幼苗株高和地下地上部分的鲜重都显著大于对照（P<0.05）。可见枯草芽孢杆菌PS-8一定程度上克服了连作障碍，对桔梗具有促生作用。

促生菌剂对连作障碍土壤的修复作用主要是通过改变土壤的微生物区系和土壤酶活性而实现的。徐彬等[11]向番茄连作障碍土壤中添加不同比例的枯草芽孢杆菌菌剂，发现番茄土壤中尖孢镰刀菌数量明显下降，土壤微生物区系发生了由“以真菌为主型”向“以细菌为主型”的转化，土壤酶的活性也向有利于土壤肥力增加和连作障碍减轻的方向转变，促进了番茄生长。向黄瓜、西瓜和猕猴桃连作障碍土壤中施入不同剂量的枯草芽孢杆菌可缓解胁迫条件下幼苗受到的伤害，提高果实的品质[14-16]。向连作土壤中施入枯草芽孢杆菌可显著提高土壤中蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶活性，明显地促进平邑甜茶幼苗的生长[12]。陈立华等[13]研究发现施用枯草芽孢杆菌生物有机肥的芦蒿茎秆和扦插苗根际土壤中尖孢镰刀菌数量分别降低了93.7%和35.7%，生防效果达到97.1%。枯草芽孢杆菌对玉米、小麦和大豆等的促生作用，也主要是通过提高其组织中过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性，降低丙二醛（MDA）含量，提高作物对土传病原菌的抵抗能力，使其免受侵害[17-19]。本研究结果与以上这些研究结果基本一致。

本研究还发现，向连作土壤中添加枯草芽孢杆菌PS-菌剂后，不仅不同添加量的各处理土壤微生物和酶等与同期对照有显著的差异，而且各处理之间也有一定的差异，有时也达到了显著的水平，同时对于施入枯草芽孢杆菌PS-8菌剂的浓度比例也不是越大就越有利于连作障碍土壤的修复改良，这与徐彬等[11]的研究结果基本一致。本研究设计了4种浓度，不论是土壤微生物群落结构、土壤酶活性、桔梗叶片中MDA含量，还是桔梗生长量，在研究中均发现2%枯草芽孢杆菌PS-8对土壤的修复作用效果最为显著。这是因为土壤是一个有机的系统，其中各种细菌、放线菌、真菌、病原微生物之间及与植物之间存在着复杂的相促和相抑关系，土壤的营养和“健康”要建立在各种微生物群落之间的平衡上，外加调节菌剂过大或不足都不利于土壤微生物平衡的建立和土壤的营养与“健康”。另外对于不同植物和不同土壤，这种平衡也可能并不完全一样。因此，用微生物接种剂对不同连作年限和不同植物的连作障碍土壤修复时，应探索不同菌剂的使用量才能达到理想效果。

另外，枯草芽孢杆菌PS-8菌剂的施入可增加土壤中细菌和放线菌的数量，降低病原菌及其总真菌的数量，增加土壤酶活。但本研究发现，随着时间的延长其影响效果有呈现下降趋势，可见外来菌株引入土壤中适应环境并大量定殖繁殖要受到土著菌株竞争的压力及土壤环境的影响。这一现象提示人们在实际生产中应用微生态菌剂克服连作障碍时，需要在适宜时期进行补施才能达到理想的改善土壤及防病效果。

相对于用化学方法，利用微生物对连作障碍土壤的修复和提高土壤营养具有绿色环保的特点和优势[24-27]。枯草芽孢杆菌之所以能对连作障碍土壤起到修复作用，与枯草芽孢杆菌对病原菌较强的竞争、重寄生和抗生作用有关，它能有效抑制土壤中尖孢镰刀菌数量增长，改变桔梗根际土壤微生物的生存环境，实现对连作土壤的生态修复。本研究通过枯草芽孢杆菌PS-8菌剂对连作障碍土壤微生态的调整和对桔梗促生作用的研究，发现枯草芽孢杆菌PS-8具有研发制成克服桔梗连作障碍生物改良剂的潜力，值得进一步开发应用。