鸭肉中硝呋烯腙残留检测提取方法探究

2022-12-20福建省农产品质量安全检验检测中心福州350003

福建畜牧兽医 2022年6期

汤优福建省农产品质量安全检验检测中心福州 350003

硝呋烯腙（Nitrovin，化学式C14H12N6O6）属于硝基呋喃类化合物的一种，是20世纪70年代中期发现的一种新型抗生素，能够促进动物生长。其作用机理是增强动物肠道黏膜的通透性，使进入动物消化道中的营养物质在消化和吸收等方面得到有效提高；同时，动物消化道中一些病原微生物对葡萄糖的利用受抑制，阻碍了其新陈代谢而受到抑制和杀灭，从而减少了动物疾病感染的机会[1]，可在猪、鸡、鸭等动物养殖中广泛应用[2]。但目前因广泛使用抗生素所带来的耐药、残留和二重感染等问题已日益凸显、严重，已成为人类需要面临的重大挑战[3]。根据国家农业农村部第250号公告：严禁硝呋烯腙用于食品动物养殖。食品动物硝呋烯腙残留检测已成为监测我国食品动物肉类安全的有效且重要的手段之一。目前，国内关于硝呋腙残留检测的研究文献较少，只有少量的用高效液相色谱法检测[4]和液相色谱串联质谱检测[5-8]等报道。本文对鸭肌肉基质中硝呋烯腙残留物检测前处理的不同提取方法进行比较、探索，确定经0.1%三氯乙酸水提取，提取液经乙腈盐析，正己烷液液分配去脂，基质固相分散净化后用超高效液相色谱-串联质谱法进行定量检测，不仅能有效排除杂质干扰，而且快速、简便、准确，可用于鸭肉中硝呋烯腙残留量的测定。

1 材料与方法

1.1 仪器超高效液相色谱串联质谱仪（型号：TQS MS/MS，美国沃特世公司）；电子天平（型号：AX105，瑞士梅特勒-托利多公司）；高速冷冻离心机（型号：D-37520，美国科俊公司）。

1.2 试剂硝呋烯腙（含量不低于97.0%），硝呋烯腙内标（C13-硝呋烯腙，含量不低于97.0%）；N,N-二甲基甲酰胺（C3H7NO）、三氯乙酸、氯化钠，均为分析纯；甲醇、甲酸、乙腈和正己烷，均为色谱纯；超纯水。

1.2.1 硝呋烯腙标准工作溶液（100 mg/L）的配制利用电子天平精密称取10 μg硝呋烯腙标准品于50 mL烧杯中，用2 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，再用0.1%甲酸-甲醇稀释后转移至100 mL容量瓶中定容，配成100 mg/L硝呋烯腙标准贮备液。使用时取适量，用甲醇稀释至合适浓度的标准工作液，应注意现用现配。

1.2.2 硝呋烯腙内标工作液（100 mg/L）的配制利用电子天平精密称取10 μg硝呋烯腙内标标准品于50 mL烧杯中，加2 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，再用0.1%甲酸-甲醇稀释并转移至100 mL容量瓶中定容，配成100 mg/L硝呋烯内标腙标准贮备液。使用时，采用甲醇稀释，配制成浓度为0.10 mg/L硝呋烯腙内标标准工作液。

1.2.3 硝呋烯腙工作曲线测定溶液配制取一定量硝呋烯腙标准工作液和C13-硝呋烯腙内标工作液，用50%乙腈水溶液稀释，硝呋烯腙稀释成2.0、5.0、10、20、50、80 μg/L系列浓度，C13-硝呋烯腙浓度为10.0 μg/L硝呋烯腙系列标准工作溶液。

1.3 仪器条件

1.3.1 液相色谱条件规格型号为BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）的色谱柱，采用35℃柱温，0.3 mL/min的流速。其中，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序为0～4.0 min，采用90%A和10%B；4.1～7.0 min，采用2%A和98%B；采用7.1～10.0 min，90%A和10%B。

1.3.2 质谱条件离子源模式电喷雾正离子源模式（ESI+），定性离子对、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表1。

表1 硝呋烯腙的定性、定量离子对及锥孔电压、碰撞能量参考值

1.4 样品处理方法取鸭肌肉部分5.00 g（精确至±0.01 g）于50 mL离心管中，加入硝呋烯腙内标工作液100 μL和0.1%三氯乙酸水溶液10 mL，2 000 r/min匀浆提取2 min后，加入20 mL乙腈，旋涡混匀。之后加入2.0 g氯化钠，旋涡混匀后8 000 r/min离心5 min；取上层清液于45℃水浴氮气吹干，用1.00 mL乙腈溶剂溶解残渣，加入10 mL乙腈饱和的正己烷，涡旋2 min后8 000 r/min离心2 min；弃去正己烷层后，加入PSA 80 mg，涡旋30 s，取上清液过膜至1.5 mL试管中。量取滤液0.5 mL于离心管中，45℃水浴氮气吹干，加入20%乙腈水溶液0.5 mL，涡旋30 s，过有机滤膜（0.22 μm），用液相色谱-串联质谱测定。

1.5 样品前处理提取条件考察实验室常用有机溶剂乙腈在不同条件下对肉鸭肌肉中硝呋烯腙的提取效率。（1）在中性pH体系下，选用去离子水环境体系和乙酸钠缓冲液体系（pH 7.7），分别用乙腈进行提取。（2）在酸性体系中，选取三种实验室常用的盐酸、甲酸和三氯乙酸作为酸性溶液考察提取效率。（3）选用酸性浓度为0.1%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈、0.1%三氯乙酸乙腈分别进行提取，考察不同酸性浓度对提取效率的影响。

2 结果与分析

2.1 样品前处理提取条件的确定试验结果见图1。去离子水环境下，乙腈对鸭肌肉中硝呋烯腙的提取效率不到40%，乙酸钠缓冲液体系下为59.1%；均低于纯乙腈提取效率59.7%；说明去离子水和缓冲液体系的加入降低了乙腈对硝呋烯腙的提取效率。在酸性体系下，乙腈在1%三氯乙酸体系中对鸭肌肉中硝呋烯腙的提取效率为64.2%；1%甲酸体系下，提取效率为77.2%；盐酸水解条件下，提取效率为13.7%。可见，酸性体系下，乙腈对肉鸭肌肉中硝呋烯腙的提取效率明显提高，但盐酸水解无法提高其提取效率；在不同的甲酸水和三氯乙酸水浓度下，0.1%三氯乙酸水浓度下乙腈的提取效率最高，为92.9%，高于甲酸体系。考虑成本、环保等因素，选择0.1%三氯乙酸溶液和乙腈作为提取溶剂。

图1 不同前处理方法比较

2.2 线性关系的考察准确量取硝呋烯腙标准工作液和C13-硝呋烯腙内标工作液，用50%乙腈水溶液将硝呋烯腙稀释至2.0、5.0、10、20、50、80 μg/L不同浓度，将C13-硝呋烯腙内标工作液稀释至10.0 μg/L，用于硝呋烯腙标准曲线测定。线性结果为Y=0.124730X+0.0582651，相关系数R2=0.997941（见图2）。