慢性心力衰竭患者外周血lncRNA MIAT和miR-214水平变化及与预后关系

薛俊芳，王 涵

1.舞阳县人民医院心内科，河南漯河 462400；2.漯河市中心医院检验科，河南漯河 462000

慢性心力衰竭(CHF)为各种常见心脏病严重终点事件之一，是老年人死亡的主要原因，而且医疗费用较高，给患者家庭和社会带来了沉重负担。CHF的高发病率、高患病率和高病死率仍然是一个社会问题，其诊断和治疗越来越受到重视[1]。

长链非编码RNA(lncRNA)属于一类长度超过 200 个核苷酸的非蛋白质编码 RNA，通过调节基因表达参与表观遗传调控。lncRNA存在于循环系统中，可作为反映心血管疾病局部疾病过程的独立生物标志物[2]。研究表明，lncRNA心肌梗死相关转录物(MIAT)参与了多种疾病的多个病理过程，包括糖尿病视网膜病变、心肌梗死、微血管功能障碍、心脏肥大和心肌纤维化[3]，其中心肌纤维化是心血管疾病进展为CHF的决定性因素。微小RNA(miRNA)的主要功能是影响基因稳定性，或者通过结合非翻译区mRNA 3′末端全部或部分抑制下游靶基因mRNA的翻译，参与生理和病理过程，影响疾病的发生和进展[4]。最近的研究发现，许多心脏疾病的发生、发展受到miRNA相关信号通路的影响，如肥大和纤维化[5]。miR-214是miRNA家族成员，可通过转录水平抑制组蛋白赖氨酸甲基转移酶 1，提高过氧化物酶体增殖物激活受体表达，进而降低心肌细胞纤维化相关基因的表达[6]，与心血管疾病存在一定的联系。本研究检测CHF患者外周血中lncRNA MIAT和miR-214的表达，研究其对CHF患者预后价值，以期为CHF提供新的临床预后诊断指标。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2021年3月在舞阳县人民医院确诊和治疗的50例CHF患者作为观察组，均接受心电图、胸部X线片、彩色多普勒超声检查，符合纽约心脏协会(NYHA)的分级标准，左室射血分数(LVEF)≤40%，左室舒张末期内径(LVEDD)>5.5 cm。观察组男28例，女22例；年龄65～81岁，平均(73.71±6.53)岁；有吸烟史23例，无吸烟史27例；体重指数(BMI) 22～25 kg/m2，平均(23.28±1.25)kg/m2；空腹血糖4.02～7.47 mmol/L，平均(5.93±1.28)mmol/L；丙氨酸氨基转移酶(AST) 15～28 U/L，平均(21.34±5.87)U/L；天门冬氨酸氨基转移酶(ALT)13～24 U/L，平均(18.64±5.24)U/L；心功能分级：Ⅱ级21例，Ⅲ级18例，Ⅳ级11例。排除自身免疫性疾病、急性冠状动脉综合征、肝功能障碍、慢性感染和恶性肿瘤患者。另选取同期在本院体检健康的受试者30例作为对照组，男16例，女14例；年龄64～79岁，平均(71.27±6.82)岁；有吸烟史14例，无吸烟史16例；BMI 23～26 kg/m2，平均(24.46±1.31)kg/m2；空腹血糖4.04～7.51 mmol/L，平均(5.71±1.65)mmol/L；AST 14～26 U/L，平均(20.17±5.38)U/L；ALT 12～25 U/L，平均(18.57±5.64)U/L。排除有心脏相关功能异常、自身免疫性疾病和高血压病史者。两组性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。该研究得到了医院伦理委员会的批准，所有受试者签署知情同意书。

1.2方法 收集患者一般资料，包括LVEDD、LVEF和脑钠肽(BNP)水平。采集患者空腹4 mL 的静脉血液标本，置于含有乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)的抗凝管中，充分混匀，并以 400×g离心 20 min分离血浆。分离的血浆储存在-80 ℃低温冰箱中备用，用于细胞因子的测定。

采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血浆lncRNA MIAT和miR-214的表达。采用TRIzol试剂盒提取收集的血浆中的总RNA。通过紫外分光光度法检测总RNA的纯度、浓度和完整性。参照说明书采用TaqMan逆转录试剂盒(Invitrogen公司，美国)进行逆转录。lncRNA MIAT和miR-214分别以GAPDH和U6为内参，引物由广州天元生物技术有限公司合成。逆转录反应体系体积为15 μL。lncRNA MIAT正向引物为5′-TATTTGCAG GGGGTGCTCTG-3′，反向引物为5′-GGGCAG GGGGTCTAACTCTA-3′，扩增长度为126 bp；GAPDH正向引物为5′-GAGCCACATCGCTCAGAACA-3′，反向引物为5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′，扩增长度为71 bp；miR-214正向引物为5′-GTCTGCCTGTCTACACTTGCT-3′，反向引物为5′-ATGTGACTGCCTGTCTGTGC-3′，扩增长度为71 bp；U6正向引物为5′-CGCCACATGGCATATTGCAC-3′，反向引物为5′-CAGCCATCGGGTATGCTAT-3，扩增长度81 bp。扩增体系：cDNA 1.0 μL，正向引物 0.4 μL，反向引物 0.4 μL，2×SYBR Green Premix Dimer Eraser，并添加无核酸酶水，最终体积为 20 μL。PCR扩增条件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共38 个循环。使用2-ΔΔCt法分析mRNA的相对表达水平。

1.3随访 所有患者接受正规治疗，并通过门诊、微信或电话进行随访。统计1年内终点事件发生情况；每2个月进行1次，以患者因心力衰竭再次入院或全因死亡为终点事件，根据是否发生终点事件分为终点事件组及无终点事件组。

2 结 果

2.1lncRNA MIAT、miR-214、BNP、LVEDD、LVEF水平比较 观察组BNP、lncRNA MIAT、LVEDD水平明显高于对照组，miR-214、LVEF明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 lncRNA MIAT、miR-214、BNP、LVEDD、LVEF水平比较

2.2终点事件组及无终点事件组一般资料比较 随访1年后，依据患者1年内是否发生终点事件分为终点事件组(28例)和无终点事件组(22例)。终点事件组及无终点事件组患者性别、吸烟史、BMI、空腹血糖、AST、ALT、LVEDD和LVEF比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。终点事件组年龄、BNP、lncRNA MIAT水平明显高于无终点事件组，miR-214明显低于无终点事件组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 终点事件组及无终点事件组一般资料比较或n(%)]

2.3相关性分析结果 Starbase在线软件预测结果显示，lncRNA MIAT靶向miR-214存在结合位点。Pearson相关性分析显示，CHF患者的lncRNA MIAT水平与LVEDD、BNP水平呈正相关(P<0.05)，与LVEF、miR-214水平呈负相关(P<0.05)；miR-214水平与LVEDD、BNP水平呈负相关(P<0.05)，与LVEF呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 相关性分析结果

2.4各指标对CHF患者预后的预测价值 ROC曲线分析显示，lncRNA MIAT+miR-214 预测CHF患者预后的曲线下面积(AUC)最大，为0.890，大于BNP、miR-214单独检测的AUC，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各指标预测CHF患者预后价值

3 讨 论

心力衰竭是世界范围内常见的健康问题，会导致残疾、生活质量和预期寿命的降低。尽管已有较多方法来处置心力衰竭，包括借助医疗器械、药理学手段和远程监控技术，但心力衰竭的临床治疗效果仍然相对较差。研究显示，多种因素与疾病的发展有关，而遗传因素在这一过程中起着核心作用。lncRNA通过调节相关基因的表达在心力衰竭发生、发展中发挥关键作用。TAN等[7]研究发现，冠心病患者血清lncRNA MIAT显著升高，其可能是冠心病诊断和预测预后的潜在标志物。YAO等[8]研究证明，MIAT 下调可减轻动脉纤维化和动脉纤维化诱导的心肌纤维化，并靶向 miR-133a-3p调节相关功能。

本研究中，观察组患者血浆中的lncRNA MIAT水平明显高于对照组，且终点事件组lncRNA MIAT水平明显高于无终点事件组，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示lncRNA MIAT可能与CHF的发生和进展有关。本研究通过相关性分析发现，lncRNA MIAT水平与LVEDD呈正相关，与LVEF呈负相关，提示lncRNA MIAT水平可以反映CHF患者的心脏损伤程度。lncRNA MIAT与BNP水平呈正相关，说明lncRNA MIAT可以反映CHF患者的预后。

基因表达失调是发生CHF的常见机制，并且miRNA在CHF的代谢调节中发挥关键作用。研究表明，miR-214在CHF患者中上调并抑制转录因子(TF)X-box结合蛋白1(XBP1)介导的内皮细胞血管生成。LI等[9]研究发现，miR-214通过调节瓣膜间质细胞的成骨分化减弱主动脉瓣钙化。而HE等[10]研究显示，miR-214-3p-Sufu-GLI1是一种新型调控轴，可控制干细胞和新生内膜增生的炎性平滑肌细胞分化。另外，miR-214在各种心脏疾病中发挥作用，包括缺血性心脏病、心脏肥大、肺动脉高压(PAH)、血管损伤后的血管生成和心力衰竭。本研究中，观察组患者血浆miR-214水平相对于对照组明显下调，且终点事件组miR-214水平明显低于无终点事件组，说明miR-214可能参与CHF的发生和疾病的进展。相关性分析发现，miR-214水平与LVEDD呈负相关，与LVEF呈正相关，提示miR-214水平与CHF患者的心脏的损伤程度有关；miR-214与BNP呈负相关，说明miR-214与CHF患者血管损伤有关。

lncRNA MIAT可能通过靶向miR-214和相关信号通路参与多种癌症的进展。例如，lncRNA MIAT水平升高可抑制miR-214表达，促进肝细胞癌患者细胞增殖；lncRNA MIAT可通过调控miR-214的表达，影响心血管疾病患者预后。LI等[11]研究发现，lncRNA MIAT 敲低通过在动脉粥样硬化过程中调节 miR-214-3p/Caspase-1 信号传导来减轻内皮细胞损伤。lncRNA-MIAT 介导的 miR-214-3p 沉默是糖尿病心肌病和心脏纤维化发生的原因[12]。本研究通过Starbase在线软件预测到lncRNA MIAT可以靶向miR-214，抑制并逆转了miR-214 对CHF的影响。相关性分析也进一步证明lncRNA MIAT可与miR-214结合。本研究中，lncRNA MIAT、miR-214、BNP对CHF患者1年内的预后预测具有一定的价值，但存在灵敏度或特异度较低的缺点；lncRNA MIAT+miR-214 预测预后的AUC为 0.890，灵敏度为61.4%，特异度为100.0%，AUC和特异度明显提高，说明lncRNA MIAT+miR-214对CHF患者预后有较好的预测价值。

总之，lncRNA MIAT可以靶向miR-214调控CHF的发生和进展，对预测CHF患者预后有一定的价值，可能成为预测CHF患者预后的标志物。但由于本研究涉及的CHF相关临床指标较少，其具体机制还不太明确，这些指标能否广泛应用于临床还有待于进一步研究。