低聚原花青素通过介导Wnt/β-catenin信号通路对糖尿病肾病大鼠肾功能的保护作用研究*

高利超，甘林望，耿磊，刘建，吴蔚桦，欧三桃

（西南医科大学附属医院 肾病内科，四川 泸州 646000）

随着我国生活水平提高，糖尿病发病率越来越高。糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最常见的并发症，DN 最终可发展为终末期肾病，导致不良预后[1-2]。积极防治DN，抑制病情进展，是避免肾衰竭，延长患者生命的主要手段。氧化应激是DN 致病机制中的重要部分，低聚原花青素是天然的抗氧化剂，具有降糖降脂、调节免疫的作用。刘尚军等[3]研究表明，原花青素能有效减轻自发性高血压大鼠肾纤维化程度，发挥肾保护功效。

近年来研究证实，Wnt 信号通路参与急性肾损伤、肾脏肿瘤等多种肾脏病变，并通过调节肾小球固有细胞的增殖与凋亡，参与肾脏疾病的发生、发展，与DN 也存在密切联系[4-6]。为研究低聚原花青素治疗DN 的具体作用机制，探究其是否能通过Wnt/β-catenin 信号通路发挥肾脏保护功效，西南医科大学附属医院开展如下研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60 只SD 雄性大鼠购自上海海利生物技术股份有限公司，体重300～320 g。大鼠自由饮食、饮水，在25℃、湿度50%的环境中喂养，12 h 昼/夜循环照明。实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2021-0005，实验动物使用许可证号：SYXK（川）2021-0014。

1.2 主要试剂与仪器

低聚原花青素（西安通泽生物科技有限公司），链脲佐菌素（美国Sigma公司），SOD、MDA检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），SABC 免疫组织化学试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗鼠Wnt4多克隆抗体、兔抗鼠β-catenin 多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），TRIzol 试剂（上海生工生物工程股份有限公司），光学显微镜及全自动生化分析仪（日本Olympus 公司），One Touch Ⅱ型血糖仪（美国强生公司），PCR扩增仪（杭州领航基因科技有限公司），-80℃冰箱（美国Thermo Scientific forma公司），低温高速离心机（美国Bckman公司）。

1.3 分组及处理

1.3.1 实验分组选择60 只SD 雄性大鼠随机分为正常对照组（NC 组）、DN 模型组（DN 组）、DN 模型+低剂量低聚原花青素组（低剂量组）、DN 模型+中剂量低聚原花青素组（中剂量组）、DN 模型+高剂量低聚原花青素组（高剂量组），每组12只。

1.3.2 处理方法①采用单次腹腔注射链脲佐菌素复制DN 模型，具体操作：将链脲佐菌素溶解于pH 4.5 柠檬酸钠，按照55 mg/kg 的比例，腹腔注射复制DN 模型。24 h 后采集大鼠尾静脉血，血糖仪监测血糖，若血糖＞16.7 mmol/L则模型复制成功。②模型复制成功后，低、中、高剂量组分别给予50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg 低聚原花青素灌胃，NC 组和DN 组给予等体积蒸馏水灌胃。连续灌胃16 周。

1.4 留取标本

分别于实验4周、8周、12周、16周末收集大鼠24 h尿量，检测24 h尿蛋白定量。16周末大鼠行腹腔麻醉，取4 mL血液，用于检测血糖、血清肌酐（serum creatinine,Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）。

固定大鼠，打开胸腔，充分暴露心脏，将注射器插入左心室，连接输液器，使PBS 溶液顺利进入心脏，用眼科剪在右心耳处剪一个小口，使血液流出，持续输入PBS液，待肾脏变白后取出左肾，去除包膜，用滤纸擦拭干，称取重量，计算肾重指数（肾脏重量/体重），取出部分肾组织，按照组织块重量与预冷匀浆体积比1∶9，冰水浴制成10%组织匀浆，2 000 r/min 离心15min，收集上清液用于检测肾组织内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量。取出部分肾脏组织固定于10% 甲醛，待行病理检查、Westernblotting及实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）。

1.5 指标检测

1.5.1 24 h 尿蛋白定量采用双缩脲法检测24 h尿蛋白定量。

1.5.2 血糖、Scr、BUN水平采用全自动生化分析仪检测血糖、Scr、BUN 水平。

1.5.3 肾组织SOD活性及MDA含量采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性，硫代巴比妥酸法检测MDA含量。

1.5.4 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）及过碘酸希夫（periodic acid-Schiff,PAS）染色观察肾组织病理形态①用10%中性甲醛固定大鼠肾脏组织24 h，将肾组织修剪为2 mm厚的组织块，乙醇脱水，二甲苯透明处理，浸泡后石蜡包埋。②HE 染色：脱蜡至水，经二甲苯处理30 min，100%乙醇、95%乙醇分别处理5 min，苏木精液染色10 min，1%盐酸乙醇处理4 s，1%氨水返蓝，伊红染色3 min，显微镜下观察。③PAS 染色：梯度乙醇脱蜡至水，高碘酸氧化液室温处理20 min，无色品红染色15 min，苏木精染细胞核15 min，1%盐酸乙醇分化数秒，95%乙醇、100%乙醇分别脱水5 min，二甲苯3 次透明。

1.5.5 Western blotting 检测肾组织Wnt4、β-catenin蛋白的表达取部分肾组织，采用玻璃匀浆器制备组织匀浆，通过SDS-PAGE 凝胶电泳对其进行分离，分别加入50 μL 兔抗鼠Wnt4 多克隆抗体（1∶200）、β-catenin 多克隆抗体（1∶100），采用ELC 增强型发光液检测Wnt4、β-catenin 蛋白的表达，以β-actin 为内参，计算各组蛋白相对表达量。

1.5.6 qRT-PCR 检测肾组织Wnt4、β-catenin mRNA 的表达①提取总RNA：取实验大鼠肾组织，加入Trizol 试剂，提取总RNA，取5 μL RNA 溶液，稀释100倍，用紫外分光光度计检测各样品OD值，按照1 个OD260 值相当于40 μg/mL RNA 计算RNA 浓度，总RNA 浓度=OD260 值×40 μg/mL×100，RNA 纯度以A260/280 表示，其值在1.8～2.2 为纯度符合要求。②RNA 逆转录：逆转录体系在冰上完成，取10 μL RNA，随机引物（0.2 μg/mL）1 μl，加去DEPC 水至12 μL，均匀后离心3 s，65℃孵育5 min，冷却30 s，加入5×Buffer 4 μL，3 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL RNA 酶抑制剂（20 u/μL），1 μL 逆转录酶（20 u/μL），最后体积为20 μL，混匀离心，25℃孵育10 min，42℃孵育1 h，72℃孵育15 min。③qRT-PCR：以逆转录所得cDNA 为模板，在聚合酶催化下进行PCR扩增，引物设计及合成均由上海生工生物工程技术有限公司完成，引物序列见表1。PCR 反应体系共20 μL，包括FastStat universsl SYYBR green master 10 μL，正反向引物各0.5 μL，CDNA 溶液2.0 μL，DNase/Rnase free ddH2O 7.0 μL。④扩增条件：94℃预变性10 min，94℃变性15 s，60℃延伸1 min，共45 个循环。⑤采用2-ΔΔCt法计算mRNA 相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血糖、Scr、BUN比较

各组大鼠血糖、Scr 及BUN 水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：DN 组血糖、Scr、BUN 水平较NC 组升高（P＜0.05）；低、中、高剂量组血糖、Scr、BUN水平较DN 组下降（P＜0.05）。见表1。

表2 各组大鼠血糖、Scr、BUN比较（n=12，）

表2 各组大鼠血糖、Scr、BUN比较（n=12，）

注：①与NC组比较，P ＜0.05；②与DN组比较，P ＜0.05。

2.2 各组大鼠不同时间点24 h尿蛋白定量的变化

各组大鼠灌胃4 周、8 周、12 周、16 周的24 h尿蛋白定量比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点24 h 尿蛋白定量有差异（F=102.38，P=0.000）。②各组24 h 尿蛋白定量有差异（F=86.58，P=0.000）。③各组24 h 尿蛋白定量变化趋势有差异（F=174.64，P=0.000）。见表3。

表3 各组大鼠不同时间点24 h尿蛋白定量比较（n=12，mg/24 h，）

表3 各组大鼠不同时间点24 h尿蛋白定量比较（n=12，mg/24 h，）

2.3 各组大鼠肾组织病理变化

肾切片HE 染色和PAS 染色光镜检查结果显示，NC 组可见正常肾小球及肾小管，肾小管上皮细胞排列整齐。DN 组大鼠肾组织部分肾小管萎缩、小管间质区基质增加，间质内见大量炎症细胞浸润，肾间质纤维化、部分肾小管上皮细胞空泡变性、脱落。低、中、高剂量组以上病理改变均较DN 组减弱，且各剂量组呈剂量依赖性减弱。见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理改变（×200）

2.4 各组大鼠左肾指数比较

NC 组、DN 组及低、中、高剂量组左肾指数分别 为（0.22±0.07）、（0.46±0.11）、（0.37±0.09）、（0.33±0.07）、（0.29±0.06），经方差分析，差异有统计学意义（F=14.605，P=0.000）。进一步两两比较结果：DN 组左肾指数较NC 组升高（P＜0.05）；低、中、高剂量组左肾指数较DN 组降低（P＜0.05）。

2.5 各组大鼠肾组织SOD活性及MDA含量比较

各组大鼠SOD 活性比较，经方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠MDA 含量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与NC 组比较，DN 组MDA 含量升高（P＜0.05），与DN 组比较，不同剂量组MDA 含量降低（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠肾组织SOD活性及MDA含量比较（n=12，）

表4 各组大鼠肾组织SOD活性及MDA含量比较（n=12，）

注：①与NC组比较，P ＜0.05；②与DN组比较，P ＜0.05。

2.6 各组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin mRNA 和蛋白表达

各组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin mRNA 和蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：DN 组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin mRNA 和蛋白相对表达量高于NC 组（P＜0.05），不同剂量组Wnt4、β-catenin mRNA 和蛋白相对表达量低于DN 组（P＜0.05）。见 表5 和图2。

表5 各组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin mRNA和蛋白相对表达量比较（n=12，）

表5 各组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin mRNA和蛋白相对表达量比较（n=12，）

注：①与NC组比较，P ＜0.05；②与DN组比较，P ＜0.05。

图2 各组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin蛋白的表达

3 讨论

肾脏是糖尿病最常累及的器官，DN 最终将发展为终末期肾病，影响患者预后。低聚原花青素是一种天然抗氧化剂，清除体内自由基的效能远高于维生素C 及维生素E[7-9]。有研究结果表明，原花青素能有效清除机体自由基，减轻心肌缺血再灌注损伤，同时还能抗动脉粥样硬化[8,10]。为研究低聚原花青素治疗DN 的作用，本研究通过复制链脲佐菌素模型DN 大鼠模型，并分别以50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg 低聚原花青素对DN 大鼠进行灌胃处理，结果发现，与NC 组比较，DN 组大鼠血糖、Scr、BUN 水平显著上升，而经不同剂量低聚原花青素干预后，以上指标水平均有所下降，且下降趋势呈剂量依赖性。本研究中各组大鼠不同时间点24 h 尿蛋白定量结果表明，NC 组各时间点24 h尿蛋白定量无明显变化，而DN 组大鼠24 h 尿蛋白定量随时间的推移呈上升趋势，且各时间点尿蛋白定量水平均明显高于NC 组。但经各剂量低聚原花青素干预后，DN 模型大鼠各时间点尿蛋白定量均明显下降，且下降幅度呈剂量依赖性。

DN最主要的病理改变有肾小管间质纤维化、肾小球硬化等，本实验中大鼠肾组织切片染色结果提示，DN 组大鼠肾组织内肾小管萎缩、小管间质区基质增生、纤维化等改变明显。而经不同剂量低聚原花青素处理后的大鼠肾组织以上改变均减轻，且减轻程度呈剂量依赖性。检测各组大鼠左肾指数也发现，DN 组肾指数明显升高，提示大鼠肾组织组成成分发生了改变，而经不同剂量低聚原花青素处理后，大鼠左肾指数有所下降，且下降程度呈剂量依赖性。以上研究结果表明，经低聚原花青素处理后，DN大鼠肾组织纤维化、肾小管硬化等病理改变减轻，24 h尿蛋白定量异常在一定程度上得到纠正，说明低聚原花青素能有效改善大鼠DN肾脏结构和临床表现。

SOD 是一类含有金属的氧化还原酶，能催化超氧化物，其活性与机体自由氧清除能力呈正相关，是机体最重要的细胞防御系统[11-13]。MDA 是组织细胞膜脂质过氧化作用的产物之一，能有效反映组织内抗氧化能力[14-15]。本研究检测各组大鼠肾脏组织匀浆上清液SOD 活性及MDA 含量发现，DN 组SOD 活性明显降低，MDA 含量明显上升，提示DN大鼠肾脏组织的抗氧化及自由基清除能力减弱。但经不同浓度低聚原花青素处理后，大鼠SOD 活性增强，MDA 含量下降，说明低聚原花青素能有效增强自由基清除能力，发挥抗氧化功能。

DN 的致病机制复杂，除氧化应激外，Wnt 信号通路也可能通过调节肾小球固有细胞的增殖与凋亡，参与肾脏疾病的发生、发展[16-19]。本研究结果也表明，DN 大鼠肾组织Wnt4、β-catenin mRNA 和蛋白相对表达量较NC 组明显升高，提示DN 大鼠肾组织内Wnt4/β-catenin 信号通路被激活，而经不同浓度低聚原花青素干预后，大鼠肾组织Wnt4、βcatenin mRNA 和蛋白相对表达量降低，提示低聚原花青素可能通过抑制Wnt4/β-catenin 信号通路，抑制DN 病情发展，减轻肾组织病理改变。

综上所述，低聚原花青素能有效降低DN 大鼠24 h 尿蛋白定量，减轻肾脏病理损害。低聚原花青素可能通过抗氧化作用及抑制Wnt4/β-catenin 信号通路，发挥肾脏保护功效，并有望成为DN 的治疗药物。