2种酰胺类杀菌剂对4种非靶标生物的急性毒性

杨石有，张 蕊，孔 琼，蒲金基，袁盛勇*，张 贺*

（1.红河学院生物科学与农学学院云南省高校滇南特色生物资源研究与利用重点实验室，云南蒙自 661199；2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海口 571101）

酰胺类杀菌剂是一类化学结构中含有酰胺结构的杀菌剂，在杀菌剂市场中占有相当重要的地位[1]。从1966年第一个酰胺类杀菌剂萎锈灵被开发成功至今，酰胺类杀菌剂经过近60年的发展，已经有数十个品种，尤其是近些年通过杂环及氟原子的引入，不断出现了一些结构新颖的酰胺类杀菌剂品种。目前，酰胺类杀菌剂已成为年销售额增长速率最快，最为活跃的杀菌剂品种之一[2-3]。噻呋酰胺是美国孟山都公司开发的噻唑酰胺类杀菌剂，具有用量少、药效高、内吸传导性强和持效期长等特点，通过抑制琥珀酸脱氢酶的形成导致菌体死亡，对多种病原菌具有较好的防效，尤其是对纹枯病防效较好[4-6]。环酰菌胺是由德国拜尔公司于1989年开发的新型酰胺类内吸性杀菌剂，主要抑制病原菌甾醇的生物合成，可用于防治灰霉病[7]。

酰胺类杀菌剂作为杀菌剂的重要类别，在作物病害防治方面发挥着重要作用。然而，由于我国目前施药器械多以手动或小型机器为主，药液雾滴粒径较大，导致在靶标叶片上的沉积量较少，很大部分药液发生飘移而流失到空气、水体、土壤中，给环境造成了严重的污染[8]。据调查，2017年我国手动喷雾器的市场占有率仍达80%[9]，其农药有效沉积率仅为10%~30%[10]。随着国家重点研发计划“化学肥料和农药减施增效综合技术研发”项目的实施，农药器械和施药技术得到快速发展，尤其是一些高效植保机械如自走式喷杆喷雾机[11]、植保无人飞机[12]、无人驾驶喷雾机器人[9]的发展，大大提高了我国的农药利用率。据报道，2020年我国水稻、小麦、玉米三大粮食作物上的农药沉积率为40.6%，比2015年提高4%[13]。虽然我国农药利用率整体得到较大提高，但还是有将近60%的农药未被充分利用而流失到环境中，对非靶标生物带来了巨大的挑战。

农药对非靶标生物的安全性评价是农药登记的必备材料，也是评价农药环境安全性的重要依据，对农药的科学合理使用具有重要的指导作用[14-15]。家蚕、蜜蜂、斑马鱼及蚯蚓是农药环境安全性评价研究中常用的靶标对象，用于反映农药在空气、水体、土壤中的暴露情况。目前，关于噻呋酰胺和环酰菌胺的研究主要集中在病害防治[4-7]、环境中的降解行为[4,16-17]等方面，而关于噻呋酰胺和环酰菌胺对非靶标生物的急性毒性研究还较少，因此有必要开展其对非靶标生物的安全性评价，了解其毒性情况，以期为该药剂的使用提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 供试生物

意大利工蜂（Apis melliifera），购于海南省儋州市那大镇养蜂场，挑选大小一致、活泼健康的成年工蜂饥饿2 h，用于急性经口毒性试验。

家蚕（Bombyx mori），卵块购于山东广通蚕种集团有限公司，品种为‘菁松×皓月’，采用常规方法催青，于（25±2）℃、相对湿度为70%～85%的恒温人工气候箱中饲养。挑选健康活泼、大小一致的2龄蚕供试。

斑马鱼（Brachydanio rerio），购于海南省儋州市那大镇花鸟市场，体长约为2 cm，于实验室驯化7 d，挑选健康活泼、大小一致的幼鱼进行试验，试验前24 h停止喂食。

赤子爱胜蚯蚓（Eisenia foetida）购于天津贾立明蚯蚓养殖中心，于室内避光驯养，待出现明显繁殖环带，挑选大小一致健康的成年蚯蚓进行试验。

1.2 供试药剂

96%噻呋酰胺原药，宁波三江益农化学有限公司；98%环酰菌胺原药，陕西恒润化学工业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 意大利工蜂急性毒性试验

参照GB/T 31270.10—2014《化学农药环境安全评价试验准则第10部分：蜜蜂急性毒性试验》[18]，测定急性经口毒性。在预试验的基础上，用50%的蔗糖水溶液分别将2种药剂稀释为5个浓度梯度，其中噻呋酰胺的浓度分别为100、200、300、400和500 mg/L，环酰菌胺的浓度分别为125、250、500、750和1 000 mg/L。取200 μL药液分别加入离心管中，称重后置于蜂笼中，向每个蜂笼中接入事先饥饿2 h的意大利工蜂各10头，并置于黑布遮盖的饲养架上，于3 h后取出离心管并称重，记录每组药液的消耗量。之后替换为50%蔗糖水溶液饲养，以不添加药剂的50%蔗糖水溶液为对照，每处理重复3次。分别于24和48 h观察记录意大利工蜂中毒症状和死亡数，计算48 h-LD50值，评价该药剂对意大利工蜂的急性经口毒性。

1.3.2 家蚕急性毒性试验

参照GB/T 31270.11—2014《化学农药环境安全评价试验准则第11部分：家蚕急性毒性试验》[19]，采用浸叶法进行测定。在预试验基础上，分别设置5个药剂浓度，其中噻呋酰胺药剂浓度分别为200、300、400、500和600 mg/L，环酰菌胺药剂浓度分别为4 000、5 000、6 000、7 000和8 000 mg/L，向不同药剂溶液中分别添加50 μL吐温-80，搅拌混合均匀即为试验药剂。将新鲜干净的桑叶置于各浓度药液中浸渍10 s，取出晾干后放入垫有滤纸的培养皿中，每皿分别接入20头2龄家蚕，每处理重复3次，以清水和加体积分数为1%丙酮的水溶液为对照。将各处理置于人工气候箱内在25℃条件下饲养，分别于24、48和96 h观察家蚕的中毒症状及死亡情况，计算96 h-LC50值，评价该药剂对家蚕的急性毒性。

1.3.3 斑马鱼急性毒性试验

参照GB/T 31270.12—2014《化学农药环境安全评价试验准则第12部分：斑马鱼急性毒性试验》[20]，采用半静态法进行测定。在预试验的基础上，用事先经过脱氯处理的自来水将噻呋酰胺和环酰菌胺母液均稀释为0.5、1、2、4和6 mg/L 5个浓度，挑选事先经过实验室驯化7 d，健康活泼，长约2 cm大小的幼鱼，分别饲养于不同浓度药液中，以事先脱氯处理并加入相同体积溶剂的自来水为空白对照，每处理重复3次，每重复10条斑马鱼。每隔24 h更换1次药液，在试验开始后6 h内随时观察记录受试鱼的中毒及死亡情况，其后在24、48、72及96 h分别观察斑马鱼的中毒症状及死亡情况，及时清除死鱼，计算96 h-LC50值，评价该药剂对斑马鱼的急性毒性。

1.3.4 赤子爱胜蚯蚓急性毒性试验

参照GB/T 31270.15—2014《化学农药环境安全评价试验准则第15部分：蚯蚓急性毒性试验》[21]，采用人工土壤接触法进行测定。在预试验的基础上，将人工土与药液充分混匀后置于通风橱中蒸发去除丙酮，使毒土中噻呋酰胺浓度分别为50、100、200、300和500 mg/kg，环酰菌胺浓度分别为100、200、400、600和800 mg/kg。用蒸馏水将土壤含水量调至30%，以不含药剂、含水量30%的人工土为对照，将土样装入标本瓶中，挑选大小一致、出现明显繁殖环带的成年蚯蚓放入标本瓶中，每处理重复3次，每重复放入10条蚯蚓。用纱布封口后置于（20±1）℃、相对湿度为80%～85%的人工培养箱中培养。分别于7和14 d观察记录蚯蚓的中毒及死亡情况，及时清除死亡的蚯蚓，计算14 d-LC50值，评价该药剂对赤子爱胜蚯蚓的急性毒性。

1.4 数据处理分析及毒性评价

采用Probit回归方法计算噻呋酰胺和环酰菌胺对4种非靶标生物的LC50值和LD50值。毒性评价依据《化学农药环境安全评价试验准则》[18-22]中的标准，评价药剂对意大利工蜂、家蚕、斑马鱼、赤子爱胜蚯蚓的毒性等级。

2 结果与分析

2.1 对意大利工蜂的急性毒性

本研究分别测定了噻呋酰胺和环酰菌胺对意大利工蜂的急性经口毒性，结果发现药剂处理后24 h，高浓度处理组意大利工蜂出现轻微中毒症状，少量中毒意大利工蜂出现激烈飞行，然后行动逐渐变缓、静止趴着不动，而低浓度处理组未出现中毒和死亡现象。48 h后，各浓度处理组意大利工蜂均出现了不同程度的中毒症状和死亡，中毒症状和死亡率与药剂浓度成正比，中毒意大利工蜂身体出现颤抖、抽搐、蜷缩现象，翅膀呈“一”或“V”字形展开，同时腹部出现发黑现象，而试验过程中对照组均未出现死亡。噻呋酰胺和环酰菌胺对意大利工蜂的48 h急性经口毒性LD50值分别为6.51和9.12 μg/蜂（表1）。根据试验准则中农药对蜜蜂的毒性等级划分标准[18]，噻呋酰胺和环酰菌胺对意大利工蜂的急性经口毒性等级均为中毒。

表1 噻呋酰胺和环酰菌胺对意大利工蜂的48 h急性毒性

2.2 对家蚕的急性毒性

本研究分别测定了噻呋酰胺和环酰菌胺对家蚕的急性毒性，结果发现处理组家蚕经浸渍桑叶给药24 h，家蚕未出现明显的中毒症状，和对照组相比差异不大。给药48 h后高浓度组家蚕出现头部翘起、取食减少，少量家蚕出现吐液、死亡情况，而低浓度处理组与对照组无明显差异，未出现死亡。给药96 h后高浓度组家蚕出现吐液、体缩及死亡现象，低浓度处理组家蚕出现拒食现象，部分家蚕还出现晃头、扭曲挣扎、假死现象，少量家蚕死亡，而试验过程中对照组家蚕均未出现死亡现象。噻呋酰胺和环酰菌胺对家蚕的急性毒性96 h-LC50值分别为375.51和5 802.32 mg/L（表2）。根据试验准则中农药对家蚕的毒性等级划分标准[19]，噻呋酰胺和环酰菌胺对家蚕的急性毒性等级为低毒。

表2 噻呋酰胺和环酰菌胺对家蚕的急性毒性（96 h）

2.3 对斑马鱼的急性毒性

本研究分别测定了噻呋酰胺和环酰菌胺对斑马鱼的急性毒性，结果发现随着药剂浓度的增加和染毒时间的延长，斑马鱼的中毒症状和死亡率呈逐渐增加趋势。高浓度药剂对斑马鱼的影响较大，斑马鱼在接触药剂短时间内活动出现异常，表现为快速游动、时而窜动等中毒症状，随后表现为反应迟缓、游速减慢、侧翻、鳃部发红、鱼体发白、腹部肿大并沉于水底。低浓度处理组斑马鱼中毒症状出现缓慢并出现少量死亡，而对照组未出现死亡现象。噻呋酰胺和环酰菌胺对斑马鱼的急性毒性96 h-LC50值分别为2.95和2.39 mg/L（表3）。根据试验准则中农药对鱼类的毒性等级划分标准[20]，噻呋酰胺和环酰菌胺对斑马鱼的急性毒性等级为中毒。

表3 噻呋酰胺和环酰菌胺对斑马鱼的急性毒性（96 h）

2.4 对赤子爱胜蚯蚓的急性毒性

本研究分别测定了噻呋酰胺和环酰菌胺对赤子爱胜蚯蚓的急性毒性，结果发现空白对照组赤子爱胜蚯蚓活动正常，无死亡现象，药剂处理组出现不同程度的死亡，死亡率与药剂浓度和暴露时间呈正相关，低浓度药剂对赤子爱胜蚯蚓影响不大。赤子爱胜蚯蚓在处理组土壤中暴露7 d后，高浓度处理组中的部分赤子爱胜蚯蚓出现身体溃烂、体液渗出等中毒症状，存活的赤子爱胜蚯蚓出现身体缩短变细、活动少、爬行困难、环带膨大等中毒症状，而低浓度处理组中的赤子爱胜蚯蚓与对照组变化不大。在毒土中暴露14 d后，中毒症状逐渐加深，死亡率增加，高浓度处理组中的赤子爱胜蚯蚓出现身体断裂、溃烂等症状，而低浓度处理组中的赤子爱胜蚯蚓出现少量死亡，身体变软。噻呋酰胺和环酰菌胺对赤子爱胜蚯蚓的急性毒性14 d-LC50值分别为171.73和383.37 mg/kg干土（表4）。根据试验准则中农药对蚯蚓的毒性等级划分标准[21]，噻呋酰胺和环酰菌胺对赤子爱胜蚯蚓的急性毒性等级为低毒。

表4 噻呋酰胺和环酰菌胺对赤子爱胜蚯蚓的急性毒性（14 d）

3 讨 论

施药技术的落后和农药的不合理使用，致使大量农药进入环境中，对非靶标生物带来了巨大的风险。开展农药对非靶标生物的安全性评价是农药开发与应用中必不可少的环节，急性毒性试验操作简单、快速，可在短时间内确定农药对非靶标生物的毒性高低，为慢性毒性试验和药剂使用提供依据和参考。

蜜蜂作为生态系统中的重要授粉昆虫，经口毒性试验可模拟田间施药后蜜蜂觅食受污染花粉的情况，反映污染物对蜜蜂的毒性大小。本研究中发现噻呋酰胺和环酰菌胺对意大利工蜂的急性经口毒性等级均为中毒，因此，在药剂使用时，应尽量避开养蜂区、开花期或者选择在无风或微风天气施药，避免药剂飘移对蜜蜂产生毒害。农药除了对蜜蜂会产生直接毒杀作用外，亚致死剂量还会干扰蜜蜂的行为，如觅食、飞行和方向感等。张宝兰等[22]发现低浓度阿维菌素会减弱蜜蜂的趋光性，造成蜜蜂的爬行、飞行等运动能力不可逆的损伤。本试验发现中毒意大利工蜂出现激烈飞行且无方向感、觅食降低、活动减弱等现象。

家蚕是重要的经济昆虫，桑叶在生长过程中容易受到周围农业生态环境和桑园自身防治病虫害所用农药的污染，导致家蚕急性或慢性中毒事件时有发生，这桑业造成一定的损失[23]。本试验中发现噻呋酰胺和环酰菌胺对家蚕的急性经口毒性等级均为低毒，说明其对家蚕安全。农药除对家蚕产生直接影响外，低浓度农药还会造成家蚕慢性中毒，影响家蚕的生长发育、生理代谢和经济性状，如眠蚕体重、全茧量、茧层量、茧层率、结茧率和化蛹率等[24-25]。本试验对96 h处理未死亡的家蚕换为健康桑叶继续饲养，发现家蚕结茧率、化蛹率、茧层量等指标均低于空白对照，说明噻呋酰胺和环酰菌胺会引起家蚕中毒，在药剂使用时应当注意施药浓度、次数、安全间隔期等，避免慢性毒性的产生。

鱼类种群是水生生态系统重要的组成部分，斑马鱼是开展农药对鱼类急性毒性和慢性毒性试验的重要生物材料，可以反映农药进入水体的风险程度。本试验中发现噻呋酰胺和环酰菌胺对斑马鱼的急性毒性等级均为中毒，这与沈艳、杨阳等[26-27]研究结果一致，二者均发现噻呋酰胺对斑马鱼的急性毒性为中毒。因此，在药剂配制时应尽量避开河道或沟渠，同时药剂施用时应尽量远离水源，严禁将使用完的农药包装品丢弃至河道或沟渠。相同的农药有效成分，不同的剂型种类对斑马鱼的毒性存在差异，24%噻呋酰胺悬浮剂对斑马鱼的急性毒性为低毒，而本试验中发现96%噻呋酰胺原药对斑马鱼的急性毒性为中毒。张国福等[28]发现不同剂型苯醚甲环唑和嘧菌酯及其原药对斑马鱼的急性毒性存在差异，毒性从高到低依次为原药、悬浮种衣剂、悬浮剂、水分散粒剂，说明经过剂型加工后可以降低药剂对斑马鱼的毒性，故在噻呋酰胺和环酰菌胺的剂型加工过程中可适当考虑向水分散粒剂或其他缓释性剂型方向发展。

蚯蚓作为土壤中的主要非靶标动物，对土壤富集营养和有机物、无机物的分解有着极其重要的作用[29]。蚯蚓对环境变化较为敏感，常作为模式生物用于土壤污染监测[30]。农药是土壤污染物的重要来源，蚯蚓可通过皮肤直接接触或取食土壤中受污染的食物而接触农药，从而引起蚯蚓死亡或影响其生长。蚯蚓急性毒性的测定方法主要有滤纸接触法、人工土壤法、饲喂法、注射法、浸入法、点滴法、强迫摄食法和自然土壤法等，人工土壤法为开展化学品对蚯蚓急性毒性试验的标准方法[31]。本研究发现噻呋酰胺和环酰菌胺对赤子爱胜蚯蚓的急性毒性等级为低毒，14 d-LC50值分别为171.73和383.37 mg/kg干土，远高于国标标准（低毒14 d-LC50值＞10 mg/kg干土）。施海燕等[32]测定了噻呋酰胺在南京黄棕壤、东北黑土、江西红壤中的降解，其半衰期分别为9.4、17.8和20.1 d；许振岚等[33]测定了环酰菌胺在红壤和水稻土中的降解，其半衰期分别为0.63和5.06 d。以上结果表明2种药剂均为易降解药剂，在土壤中的残存期短，对蚯蚓的安全性较好。

开展农药对非靶标生物的急性毒性试验可在较快时间内获得农药对非靶标生物的安全性数据，对农药的环境安全性评价和药剂使用具有重要的指导作用。有关2种药剂对4种非靶标生物的慢性毒性还未知，本团队将在接下来的研究中继续开展慢性毒性试验，以期为2种药剂的使用提供数据支撑。