基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法在婴幼儿食品蜡样芽胞杆菌检测中的应用

杨纯佳，蒋 轩，张 娟，黄翠莉

广东省食品生物危害因素监测工程技术研究中心，广东产品质量监督检验研究院，广东佛山 528300

0 引言

蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）是芽胞杆菌属中的一种，为革兰氏阳性菌，广泛存在于周围环境中[1，2]，可引起食物中毒，通常表现为腹泻、呕吐[3～5]。蜡样芽胞杆菌在婴幼儿配方奶粉、辅食及生产加工多环节中均有不同程度的检出[6，7]，引起的婴儿腹泻在我国也时常发生[8]。各地政府虽然对婴幼儿食品进行了重点监管，但我国国家标准对婴儿食品中蜡样芽胞杆菌并没有限量要求，婴幼儿属于免疫力低下群体，稍有不慎，即存在感染风险，因此，对其的检测和限量非常有必要。

目前蜡样芽胞杆菌的检测方法还是以传统的生化培养法为主，操作复杂，检测时间长。虽然分子生物学等检测技术也在不断完善[9，10]，但其成本较高，对人员专业能力也要求高，无法实现大规模普及。而基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法作为一种新型的技术，具有快速、准确、高通量、低成本等特点，在诸多领域已经得到广泛应用[11，12]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法是基于微生物蛋白质的一种鉴定方法，将纯化的菌种均匀涂抹于靶板上，滴加基质液，干燥后，通过一脉冲激光的照射，基质吸收高能量而爆炸，通过样品链发生离子化的过程，采集质谱图与数据库中标准图谱进行比对分析得出鉴定结果[13]。本文以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法为主要检测技术，对比国标法、VITEK 2 Compact和实时荧光PCR法的结果，对三类婴幼儿食品（包括婴幼儿配方食品、较大婴儿和幼儿配方食品、婴幼儿谷类辅助食品）中蜡样芽胞杆菌的污染情况进行调查研究，为乳品企业提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

通过各大超市、母婴用品店以及网购采集了560 份婴幼儿食品，包括82 份婴幼儿配方食品、168 份较大婴儿和幼儿配方食品以及310 份婴幼儿谷类辅助食品。

1.2 材料与设备

甘露醇卵黄多黏菌素（MYP）琼脂、胰酪胨大豆多黏菌素肉汤、营养琼脂、动力培养基、酪蛋白琼脂、硫酸锰营养琼脂培养基、蜡样芽胞杆菌生化鉴定试剂盒等，广东环凯微生物科技有限公司。

Premix Taq DNA聚合酶，日本TaKaRa公司；食品基因组提取试剂盒、细菌基因组提取试剂盒，Omega Bio-Tek公司；引物和探针，上海生工生物公司。

AutofMS1000质谱鉴定仪，郑州安图生物有限公司；GHP-9160 隔水式恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定分析仪，法国生物梅里埃公司；AC2-6S1生物安全柜，美国ESCO 公司；QuantStudio 7 Flex 荧光PCR仪，美国Thermo 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 前处理方法

按照GB 4789.14—2014[14]中第一法的检测流程进行检验。无菌条件下取25 g样品，加入盛有225 mL磷酸盐缓冲液的均质袋中，拍打混匀，作为1∶10的样品匀液，制备10倍系列稀释样品匀液，选择2～3 个适宜的稀释度，每个稀释度分别吸取0.3 mL，0.3 mL，0.4 mL匀液涂布于MYP琼脂平板上，（30±1）℃培养24～48 h，对典型菌落进行确认和计数。

1.3.2 鉴定方法

（1）国标法

挑取典型菌落，按照GB 4789.14—2014[14]中4.3对典型菌落进行染色镜检、过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、溶菌酶耐性试验、卵黄反应、V-P 试验、葡萄糖利用（厌氧）试验、甘露醇产酸、根状生长试验、溶血试验和蛋白质毒素结晶试验。

（2）基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法

挑取典型菌落进行分离纯化后使用直涂法上机检测，取适量纯化后单菌落均匀涂布于靶板上，加入1 μL基质溶液，晾干。将靶板放入质谱仪进行鉴定。基质液配制：20∶19∶1（50%乙腈+47.5%水+2.5%三氟乙酸）比例配制，充分溶解（超声）溶质（α-腈基-4-羟基肉桂酸，HCCA），制成过饱和溶液。

（3）VITEK 2 Compact 检测方法

挑取典型菌落于TSA培养基上分离纯化，将分离的单菌落用无菌棉签擦拭于0.45%无菌生理盐水中充分混匀制成菌悬液，将此菌悬液调至1.8～2.2麦氏比浊度，用BCL鉴定卡上机，鉴定结果需补充根状生长试验和蛋白质毒素结晶试验。

（4）实时荧光PCR法检测蜡样芽胞杆菌

参照SN/T 3932—2014[15]进行检测。取3.4.1中的增菌液用商品化细菌基因提取试剂盒进行DNA提取。荧光PCR检测按标准要求操作，根据样品Ct值报告检测结果。

2 结果与讨论

2.1 婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌的污染状况

婴幼儿配方食品和较大婴儿和幼儿配方食品的检出率分别为14.63%和15.48%，婴幼儿谷类辅助食品检出率为7.74%，婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌的总检出率为11.07%。其中检测结果大于100 CFU/g的总共有8 份（表1）。婴幼儿配方食品以及较大婴儿和幼儿配方食品的污染率相比婴幼儿谷类辅助食品较高，这种情况可能与生产加工环节有关。谷类辅助食品在生产加工过程中有高温加热环节，使灭菌更为彻底，故污染率较低[16]。对于污染较为严重的产品类别应加大对生产加工环节进行监管。

表1 婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌的检出情况

2.2 四种检测方法在婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌的检测情况

本次检测采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法、国标法、VITEK 2 Compact 检测方法和实时荧光PCR法对可疑蜡样芽胞杆菌进行鉴定。对560份样品的检测，结果显示四种检测方法的定性结果一致，结果见表2，对比发现，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法准确度高、耗时短、高通量、成本低、灵敏度高，可用于应对突发事件的快速筛查。

表2 四种鉴定方法的比较

3 结论

3.1 本研究比较了4 种蜡样芽胞杆菌的检测方法，结果发现基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法具有高通量、灵敏度高、准确度高、操作简单等优势，鉴定结果只需要几分钟，较大地缩短了菌种的鉴定时间，适用于婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌初筛和快速检测。

3.2 市售婴幼儿食品中存在蜡样芽胞杆菌的污染，具有一定的食品安全风险，应引起警惕。预防和控制蜡样芽胞杆菌感染的关键是从原料、生产环节、生产环境等多个方面严格把关加大对企业生产的监管力度，同时，由于蜡样芽胞杆菌的芽胞具有强大的抵抗力，繁殖较快，建议有关部门考虑在国家安全标准中增加婴幼儿配方食品中蜡样芽胞杆菌的限量要求，保障婴幼儿食品的食用安全性。