基于新国标的两种微生物法测定乳粉中叶酸的比对研究
2022-12-14严家俊姚丽锋黄翠莉吴思敏
严家俊，姚丽锋，綦 艳，张 娟，黄翠莉，吴思敏
1 广东产品质量监督检验研究院，广东佛山 528300 2 拱北海关技术中心，广东珠海 519015
0 引言
叶酸是一种由对氨基苯甲酸、蝶呤和谷氨酸组成的B族维生素[1]。为维持人体正常生理功能所必需。然而，人体自身无法合成叶酸，需通过外部摄取补充。缺乏叶酸会导致人类疾病，如神经管畸形、先天性心脏病、儿童哮喘等[2，3]。但是过量摄入叶酸也会引起一些并发症，如干扰抗惊厥药物发挥作用和机体对锌的吸收、掩盖VB12缺乏的初期表现、神经发育毒性等[4，5]。
乳粉作为婴幼儿早期营养摄入的主要来源，对其质量控制及其重要。我国即将施行的标准《GB 10765—2021食品安全国家标准婴儿配方食品》《GB 10766—2021食品安全国家标准较大婴儿配方食品》《GB 10767—2021 食品安全国家标准幼儿配方食品》均对叶酸的添加量进行了更严格的规定，婴儿食品中叶酸限量由2.5～12 μg/kJ更新为2.9～12 μg/kJ，幼儿食品中叶酸限量由不小于1 μg/kJ更新为2.4～12 μg/kJ。因此，对婴幼儿乳粉中叶酸含量的检测具有重大的意义。
目前叶酸的测定方法主要有化学发光法[6]、紫外吸收光谱法[7]、荧光分析法[8]、高效液相色谱法[9]、酶联免疫法（ELISA）[10]、伏安法[11]和微生物法[12，13]等。其中微生物法是经典的叶酸测定方法，能反映样品中总叶酸含量[14]。作为食品中叶酸含量检测的国标指定方法，《GB 5009.211—2022 食品安全国家标准食品中叶酸的测定》已于2022年6月发布更新，并将于2022年12月实施，新标准依旧将微生物法作为食品中叶酸测定的唯一方法。与2014版的标准相比，新标准增加了微孔板测定方法。本研究通过对即将实施的标准GB 5009.211—2022中试管法和微孔板法检测乳粉中叶酸进行比较，根据数据的差异与试验情况比对两种方法的优缺点，为乳粉中叶酸含量测定以及新标准的实施提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料
叶酸标准品（纯度≥97%）；氢氧化钠乙醇溶液（0.01 moL/L）；鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus Caseispp. RhamnosusATCC 7469）；菌种储备用琼脂培养基；叶酸测定用培养基。
1.2 仪器与设备
XGI.D型真空灭菌器，山东新华医疗器械股份有限公司；ZQZY-CS8V振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；5804R高速冷冻离心机，德国艾本德股份公司；ML204万分之一电子天平，梅特勒-托利多国际有限公司；UV-1900分光光度计，岛津企业管理（中国）有限公司；Vortex-Genie 2涡旋混合器，美国Scientific Industries。
1.3 试验方法
1.3.1 标准工作液的制备
准确称取一定量的叶酸标准品，用氢氧化钠乙醇溶液逐步稀释至0.200 ng/mL，制成标准工作液。
1.3.2 接种液的制备
将鼠李糖乳杆菌连续转种3 代后，接种至菌种储备用琼脂培养基中，36 ℃培养24 h。取2 mL叶酸标准工作液与4 mL叶酸测定用培养基混匀，分装至2 支试管中，高压灭菌制成种子培养液。将活化后的菌株转接与种子培养液中，36 ℃培养24 h后，吸取0.5 mL至无菌叶酸测定用培养基中，36 ℃培养6 h，制成接种液。
1.3.3 样液的制备
准确称取1.000 g样品，精确至0.001 g，加入80.000 mL氢氧化钠乙醇溶液，超声振荡2～4 h后，转入100.000 mL容量瓶中，用水定容，摇匀。再用水进行适当的稀释。
1.3.4 试管法
（1）试样系列管
取试管，分别加入1.000 mL、2.000 mL、3.000 mL试样稀释液，补水至5.000 mL。每梯度做2 个平行。
（2）标准系列管
取试管分别加入叶酸标准工作液，补水至5.000 mL，使标准系列管中叶酸含量分别为0.000 ng、0.050 ng、0.100 ng、0.200 ng、0.300 ng、0.400 ng、0.500 ng、0.600 ng、0.800 ng、1.000 ng。每个标准点做3 个平行。
（3）灭菌、接种与培养
将测定系列管、叶酸测定培养基于121 ℃灭菌5 min，冷却至室温后，加入一定量的接种液至叶酸培养基中，使其接种液浓度为4‰，5.000 mL每管分装于每支测定管中，另取一支标准0管加入叶酸测定培养基作为0对照管。混匀后，置于36 ℃培养20～40 h，直至获最大浊度。
（4）测定
使用混匀振荡器将培养好的试管混匀，于540 nm处，以0对照管调节吸光度值为0，依次测定各试管培养液。
1.3.5 微孔板法
（1）试样系列管
使用0.22 μm无菌水相滤膜过滤除菌试样稀释液，取1.500 mL离心管，分别加入100 μL、200 μL、300 μL试样稀释液，补水至500 μL。每梯度做2 个平行。
（2）标准系列管
按1.3.4（2）中制备方式，体积按比例缩减至1.0 mL。无菌条件下，使用0.22 μm无菌水相滤膜过滤除菌至1.500 mL离心管中。每个标准点做3 个平行。
（3）灭菌、接种与培养
叶酸测定培养基于121 ℃灭菌5 min，冷却至室温后，加入一定量的接种液至叶酸培养基中，使其接种液浓度为4‰，吸取150 μL加入微孔板中。另吸取150 μL标准系列管或试样系列管加入微孔板中，覆膜，混匀，置于36 ℃培养32～40 h。
（4）测定
混匀微孔板中培养物，于540 nm处测定吸光度值。
1.3.6 计算
以标准系列管中叶酸的含量为横坐标，各个标准点吸光度值的平均值为纵坐标，绘制标准曲线。通过标准曲线换算试样系列管中叶酸的相应含量，以此计算样品中叶酸的含量。
2 结果与分析
2.1 准确度试验
以SRM 1869乳基标准物质做为样品，分别使用两种方法独立重复测定6 次，计算结果的与真值的符合程度和相对标准偏差（Relative tandard Deviation，RSD），以此衡量两种方法的准确度。结果如表1所示。
表1 试管法与微孔板法测定SRM 1869 中叶酸含量的比较
由SRM 1869说明书可知，该样品中叶酸含量为（223.9±8.6）μg/100g，2 种方法所测结果都与标示值相符，满足要求，方法的准确性良好。两种方法的RSD分别为2.7%和2.9%，无明显差异。
2.2 重复性试验
随机选取5 种不同的乳粉作为试验样品，使用两种方法分别对每个样品进行6 次重复性试验，观察测量结果之间的一致性，结果如表2、表3所示。
表2 试管法的重复性试验结果
从表2结果可知，利用试管法检测的5 种不同品牌的乳粉中叶酸含量，每个样品的6 个测定结果较接近，RSD值为1.3%～3.1%，说明方法重复性较好；从表3结果可知，利用微孔板法检测的5 种不同品牌的乳粉中叶酸含量，每个样品的6 个测定结果较接近，RSD值为1.6%～2.9%，说明方法重复性同样较好。
表 3 微孔板法的重复性试验结果
3 结论与讨论
从试验结果比较可知，两种方法检测结果都与乳基标准物质1869证书中叶酸标示值相符，方法的准确性良好，且无明显差异。重复性试验结果可知，利用GB 5009.211—2022试管法检测叶酸含量，试验结果之间一致性较好，RSD值为1.3%～3.1%。利用GB 5009.211—2022微孔板法检测叶酸含量，试验结果之间一致性同样较好，RSD值为1.6%～2.9%。两种方法均能有效检测乳粉中叶酸含量。
比较两种方法的差异。在制备方面，试管法的样液和标液使用高压灭菌锅灭菌。微孔板法使用无菌水相滤膜对样液和标液进行过滤除菌。考虑到在进行大批量样品的测定时，试管法需要用到大量试管，灭菌时占用的空间较大，一般灭菌锅无法满足同时灭菌的需求，需要用到大容量或多个灭菌锅进行灭菌。而微孔板法只需使用滤膜进行过滤灭菌，相对而言，效率更高。且使用滤膜过滤灭菌可以一定程度去除背景混浊，使试验结果更稳定。培养方面，相对于试管法，微孔板将培养物置于微孔板中，体积缩小，占用空间更小，可于一个培养箱中进行大量样品的培养。测定方面，试管法将各管用振荡器混匀后，使用比色杯逐个管进行测定，需要耗费大量的时间。而微孔板直接将整板混匀后，置于酶标仪中测定，测定时间更加快速。故建议在进行大批量样品的测定时，优先选用微孔板法进行试验。在试验成本方面，试管法每管需加入5 mL叶酸测定培养基，且对试管的需求量大且要求较高。微孔板法每孔只需150 μL培养基，微孔板为一次性耗材且每板可加96 个培养物，成本更低。
本研究通过对新标准两种微生物法检测乳粉中叶酸含量结果的准确度与重复性进行比较，两种方法的准确度和重复性都较好。相对于试管法，微孔板法效率更高，成本更低，适用于大批量样品的检测需求。
