北京市延庆区牛口蹄疫免疫抗体检测与防控

2022-12-14王艾晶

中国乳业 2022年11期

王艾晶

北京市延庆区动物疫病预防控制中心，北京延庆 102100

0 引言

牛口蹄疫又称为“口疮”，是由口蹄疫病毒引起的急性、热性、接触性传染病，被世界动物卫生组织（WHO）列为法定上报的动物传染病，我国将其列为重点防范的一类传染病。口蹄疫病毒易发生变异，目前有7 个血清型：A、C、O、SAT1、SAT2、SAT3、Aisa I，我国主要流行的是A型、O型和Aisa I型，但在2009年后Aisa I型未见报道[1]。

口蹄疫临床典型特点是口腔黏膜、蹄部和乳房出现水泡，且水泡中存在大量病毒。口蹄疫潜伏期一般为2～4 天，最长可达7 天，牛体温突然升高至40～41 ℃，精神不振，食欲减退，流口水，唇内、舌面等处出现水泡，口水渐变成白色泡沫，水泡破裂后变成糜烂组织，严重影响奶牛采食、走路和泌乳。犊牛感染口蹄疫后常伴有心肌受损或出血性肠炎，故死亡率较高。

口蹄疫传播速度快、途径多、范围广，病牛及其分泌物或排泄物或精液都是污染源；通过消化道、皮肤黏膜和呼吸道均能感染该病，严重危害了牛群健康，给养殖户带来了巨大经济损失。北京市延庆区是北京市奶牛存栏量较大的区，对北京市奶牛业的发展起到举足轻重的作用。因此要全面了解和精准掌握该区口蹄疫的发生风险，科学应对口蹄疫免疫和检测工作中存在的问题，努力采取综合防控措施为首都奶牛养殖业健康可持续发展保驾护航。

1 延庆区牛口蹄疫免疫状况

畜禽免疫是有效防控动物疫情，人畜共患病发生的基础性工作。根据北京市动物免疫计划，结合延庆区实际情况，实行养殖场程序化免疫，散养户集中免疫与查漏补针相结合的工作模式，确保应免免疫密度达到100%。程序化免疫由养殖场（户）自行组织实施，动物疫病预防控制机构做好免疫督导检查和免疫效果监测评估；对不具备自行免疫能力的散养户在每年3月、7月、11月开展集中免疫工作，其余时间进行查漏补免，免疫操作由包片兽医和村级防疫员入村入户实施完成，努力做到村不漏户，户不漏针。目前，延庆区第一次集中免疫工作已圆满完成。据统计，奶牛存栏6729 头，其中规模场13 个，存栏6543 头，散养9 个村，10 户，存栏186 头。北京市统一使用的是口蹄疫O-A二价苗，延庆区应免疫6340 头，实际免疫6340 头，应免免疫密度为100%。

2 延庆区牛口蹄疫监测状况

科学评估免疫效果，对口蹄疫的防控有重要意义。延庆区口蹄疫抗体监测包括集中监测、自免场监测、应急监测和跟踪监测。一般在免疫28 天后开展抗体监测工作，针对不合格的场（户）要及时分析原因，通知养殖场（户）做好补免工作。目前，第一次集中免疫工作已圆满完成，共监测牛口蹄疫样品1310 份。

3 延庆区牛A/O型口蹄疫检测方法

3.1 样品的采集

采用随机抽样的方法，对全区13 个奶牛养殖场605 份血样和10 个散养户50 份血样进行采血检测。采血部位是颈静脉或尾静脉，一牛一针，要求每份血样不少于5 mL且标记清楚，采集完毕立即送达化验室。规模场采样不少于存栏量10%，散户每户5 份。

3.2 仪器设备

单道和多道移液器，德国Eppendorf公司；酶标仪，伯乐公司。

3.3 试剂盒

口蹄疫O/A型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒，兰州兽研生物科技有限公司。

3.4 检测方法

3. 4.1 试验前准备

从冰箱冷藏中取出试剂盒，置于室温平衡10～30 min；配制磷酸盐-吐温缓冲液（PBST）：25 倍的PBST浓缩液用去离子水稀释成1 倍PBST（1 份浓缩液加入24 份水进行稀释），用于洗板和血清稀释；口蹄疫A/O型病毒抗原配制：将试剂盒配备的口蹄疫A/O病毒冻干抗原用1 mL去离子水溶解，溶解后-20 ℃保存，使用时按照工作浓度1:55配制。

分离送检的655 份奶牛血样：用普通离心机分离牛血样，将上层血清倒入深孔板中，封模后，做好标记，4 ℃保存待用。

3.4.2 操作步骤

3.4.2.1 抗原抗体（阴阳对照血清及待检血清）反应

首先，进行血清稀释。在酶标板上，以50 μL/孔的量用PBST 2 倍连续稀释血清，被检血清在第1-10列从1∶4稀释至1∶512；在第11列稀释阳性对照血清，从1∶2稀释至1∶256；A12-B12孔稀释阴性对照血清，从1∶2稀释至1∶4；E12-H12孔为病毒抗原对照孔。

其次，加病毒抗原。将病毒抗原用抗原稀释液稀释至工作浓度，以50 μL/孔的量加入到被检血清、阴阳性对照血清的每一稀释孔内，4 孔病毒抗原对照孔仅加入100 μL/孔稀释至工作浓度的病毒抗原。加入等量的病毒抗原后，血清的稀释度加倍，被检血清从1∶8～1∶1024，由于阳性对照血清已经预先作了8 倍稀释，则变为1∶2～1∶4096。封板后，轻微振荡，37 ℃温育30 min。

3.4.2.2 用PBST连续洗板3 次，拍干，按50 μL/孔加口蹄疫A/O型酶标抗体工作液，封板，37 ℃温育30 min。

3.4.2.3 用PBST连续洗板3 次，拍干。将TMB底物A溶液和B溶液以1∶1比例混匀，加入混匀后的底物溶液50 μL/孔，置37 ℃显色15 min。

3.4.2.4 显色反应结束后，加终止液50 μL/孔，终止反应，在酶标仪上读取D450nm值，计算结果。

3.4.3 试验成立条件和结果判定参照试剂盒说明书。

4 结果与分析

抗体检测结果统计见表1。由表1可知，口蹄疫A型免疫抗体合格率为95.1%，口蹄疫O型免疫抗体合格率为93.5%，结果均超过70%，达到原农业部的部颁标准（GB/T 18935—2018），表明口蹄疫O-A二价苗的免疫效果较好，延庆区奶牛总体处于免疫保护状态下，发生口蹄疫疫病的风险较低。

表1 牛口蹄疫A/O型抗体ELISA结果

5 讨论

全区奶牛口蹄疫抗体监测研究表明：延庆区13 个奶牛规模养殖场的免疫主体责任意识较强，各自均制定了自免程序方案并能按照方案扎实开展奶牛口蹄疫免疫工作，各项操作规范化，管理水平科学化，通过监测结果反馈出口蹄疫发生的风险很低。

延庆区10 个养牛散户中，9 个养殖户两项检测都合格，仅有1 户两项检测均不合格，该户发生口蹄疫的风险很大，其免疫抗体效果有待提高。动物疫病监测机构已将结果及时反馈给当地的基层兽医机构，要求及时补免，适时开展追踪监测。

通过对养殖户进行实地走访发现防疫工作中存在两方面问题：一是该养牛户的免疫主体责任意识差，对于免疫工作和监测工作存在抵触心理。他们认为只要奶牛当下不生病，免疫就无关紧要，加之，免疫时存在过敏反应风险，政府对奶牛流产或死亡的补偿资金多年来一直未变，与市场行情有一定差距，所以一旦发生过敏反应，可能会给养牛户带来经济损失，导致养殖户容易产生拒免心理。另外，在采血监测过程中，可能会加大奶牛应激反应，造成奶牛产奶量下降。有些防疫员采血操作不规范，会对奶牛造成伤害。加之，采样没有任何补贴，故养殖户不能保证一牛一针；二是基层兽医站冷链相关的基础设施差，疫苗的储存和运输不符合要求，如冷藏冰箱又小又旧，防疫员用的冷藏箱使用时间过长，冷藏效果差，降低了疫苗质量，影响了后续的使用效果。

6 防控建议

6.1 加强免疫与档案管理

对符合免疫的牛只实行强制免疫，要求应免免疫密度达到100%，对新补栏的牛、免疫不合格的牛要及时进行补免，建立免疫屏障，使抗体水平常年维持在较高水平，这是防止口蹄疫疫病发生最有效的手段[2]。

建立健全免疫档案，严格执行登记制度。动物免疫完成后防疫员要及时填写《北京市动物免疫登记册》，对病畜、临产畜、新生畜、过敏畜等要严格执行登记制度。存栏数据、免疫数据等基础性数据设专人建立和规范管理电子、纸质双重档案，且必须做到填写规范、详细、真实、准确、及时，为后续可能的溯源工作提供有力证据。

6.2 加大检疫与监测

动物疫病检疫机构要严格遵守检疫制度，从源头上遏制不明来源、未经免疫、免疫不合格或来自疫区的奶牛流入市场。对养牛户新购的奶牛要详细、准确登记备案，根据相关疫病检测结果是否合格来出具检疫证明，一旦出现弄虚作假，按照检疫法相关规定执行。提倡养殖户自繁自养，确需引种时，要选择信誉高的商家，并按照当地规定，及时报备，严格隔离，认真观察，采血检测，待保证牛只健康后才可混群。

动物疫病预防控制机构要制定全年监测计划，针对重点区域要加大监测频次，客观评价免疫效果，针对不合格的场（户）及时通知基层单位进行补免，消除疫情隐患。

6.3 严格消毒与封闭管理

养殖场进行定期、严格的消毒，对消灭传染源，切断传播途径意义重大。每个养殖场需建立严格的消毒制度，设专人定期定时对圈舍、器械、食槽、牛体等进行消毒[3]。消毒药品种类繁多，常用的有过氧乙酸、聚维酮碘等，为防止不同消毒剂间相互干扰，一般建议使用1～2 种。对圈舍、运动场地等环境的消毒常采用喷洒的方法，可以将奶牛驱赶到空闲处，再无死角全方位消毒，也有采用紫外照射等方法进行消毒灭源。

对奶牛场要进行封闭管理，与生活区分开，牛场外围要设立高墙、防护网等。外来人员及车辆需进行消毒后，从专门通道进入牛场。免疫人员在进出场前，也要做好鞋帽及器械的消毒工作，严禁人为造成交叉感染。

6.4 强化宣传与培训

各乡镇政府、各动物疫病预防控制机构、各基层机构要采用多种方式、通过多种途径来宣传口蹄疫疫病的危害性，强调做好免疫工作的重要性，减轻和消除养殖者对疫病免疫存在的抵触心理，使他们深刻认识到疫病免疫的不可替代性，配合工作，积极免疫。

在免疫工作开始前，加强对包片兽医和防疫员的技术指导，确保免疫质量，对免疫结果负责。采取理论与实操相结合的方式进行培训，内容主要涉及疫苗的配比与保存、注射部位选取、过敏反应救治、血样采集操作、冷链运输管理、个人防护事项等，以此来提高基层免疫人员的专业水平，增强人身安全。免疫过程中要切实落实“消毒严、部位对、剂量准”的操作规范，做到一牛一针，保质保量完成免疫工作。