高粱LKR基因结构及在种子发育中的表达特征分析

李欣宇，徐启宇，卫宇翔，王景雪

（山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006）

高粱（Sorghum bicolor）是仅次于玉米、小麦、水稻和大麦的全球第五大谷类作物。高粱具有突出的抗旱、高产、耐盐碱等特性，其籽粒中除了含有大量碳水化合物外，富含B族维生素和微量元素[1-2]。但是高粱籽粒中缺乏赖氨酸[3]，赖氨酸是谷物中的第一限制性必需氨基酸，在人体生长发育和免疫方面发挥重要作用[4]。对以食用高粱为主的人或动物，缺乏赖氨酸，会导致营养不均衡。提高高粱籽粒中赖氨酸的含量可以提高对蛋白质的利用率，改善高粱的营养价值，对于食用高粱和饲用高粱具有重要的价值。因此，研究赖氨酸合成降解途径中的关键酶基因，对于利用生物技术提高高粱籽粒赖氨酸含量、改善营养品质具有重要意义。

在植物中，赖氨酸的合成依赖天冬氨酸代谢途径，主要受天冬氨酸激酶（Aspartate kinase，AK）和二氢吡啶羧酸合酶（Dihydrodipicolinate synthase，DHPS）2种关键酶调控。它们具有相同的表达模式，在种子中的表达高于其他组织部位如根、茎、叶、花，并且基因表达受非生物胁迫和与光合作用相关的信号调节分子等调控[5]。而酵母氨酸途径是植物赖氨酸降解的主要代谢途径。酵母氨酸途径的关键步骤是由赖氨酸酮戊二酸还原酶（Lysineketoglutarate reductase，LKR）和酵母氨酸脱氢酶（Saccharopine dehydrogenase，SDH）催 化 完 成。LKR将赖氨酸和α-酮戊二酸还原成酵母氨酸，然后被SDH转化为α-氨基己二酸半醛和谷氨酸[6]。

赖氨酸酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶（LKR/SDH）是连接在单个多肽链上的一对双功能酶，在赖氨酸降解的起始、中间步骤中起催化作用，在赖氨酸代谢过程中具有十分重要的作用[7-8]。LKR/SDH基因主要在植物种子中表达，单、双子叶植物的表达模式有差异，已在一些物种如双子叶植物大豆[9]、菜豆[10]及单子叶植物玉米[11]、水稻[12]中分离纯化，表征了分子特征。该基因的表达受发育、激素水平和应激相关转录因子等的复合调控，例如在盐和渗透胁迫下，发现LKR/SDH基因表达增加[13]。运用代谢工程技术，提高植物籽粒赖氨酸含量已经在禾本科作物的大麦、水稻和玉米等植物中取得了成功。REYES等[14]在抑制玉米胚乳中LKR/SDH酶活性的转基因植株中，发现胚乳中游离赖氨酸含量增加，并在授粉后32 d时含量最高；ZHU等[15]在拟南芥中敲除LKR基因且转入DHPS基因，种子中赖氨酸含量增加了约80倍；LONG等[16]在水稻中构建干扰LKR及SDH基因的双元载体，发现转基因植物的游离赖氨酸在种子中增加约60倍。

本研究利用生物信息学软件对高粱LKR基因的基本理化性质、蛋白质结构特征等进行分析，同时利用qRT-PCR分析高梁种子发育时期的基因表达模式，为进一步研究高粱LKR基因的功能和调控机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为高粱品种BTX623，由山西农业大学高粱研究所提供，种植于山西农业大学高粱研究所试验田。

1.2 试验方法

1.2.1 生物信息学分析本研究中所有物种的LKR基因与蛋白序列均从NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获取，包括：小麦（ADJ19186.1）、高 粱（XP002452934.1）、谷 子（XP004954151.1）、水 稻（BAJ25847.1）、玉 米（NP001104873.1）等。利用Pfam在 线 网 站（http://www.pfam.xfam.org/）对LKR蛋白保守结构域进行分析[17]，NetSurfP-2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/）预测高粱LKR蛋白的二级结构[18]；利用SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org/）预测高粱LKR蛋白的三级结构[19]；利用Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）分析高粱LKR蛋白的理化性质[20]；利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）分析高粱LKR蛋白的亲疏水性[21]；利用SignalP5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/Sig‐nalP/）预 测 高 粱LKR蛋 白 的 信 号 肽[22]；利 用TMHMM Server.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/ser‐vices/TMHMM/）软件分析高粱LKR蛋白的跨膜结构[23]；利用NetPhos3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）对蛋白质磷酸化位点进行分析[24]。利用在线分析软件PSORTII Prediction（https://psort.hgc.jp/form2.html）对LKR蛋白进行亚细胞定位预测[25]；利用在线软件MapGene2 Chrom web v2（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）进行染色体定位图谱的绘制[26]；利用MEGA 7.0软件对所有LKR蛋白进行多序列比对，并采用邻接法构建系统进化树，进化树bootstrap重复值设置为1 000，采用Evolview v3（https://www.evolgenius.info/）进行图片处理[27]。

1.2.2LKR基因的表达分析使用Trizol法[28]提取高粱授粉后5、10、15、20、25 d时种子总RNA并反转录成cDNA，作为荧光实时定量PCR的模板DNA。反转录按照Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒说明书进行操作，一般为20.0μL体系，退火温度53℃，反应30 s，进行40个循环。以高粱肌动蛋白基因（Actin）为内参基因，所用引物序列如表1所示，定量PCR数据的分析采用2-∆∆Ct法，各反应设置3个重复。

表1 用于qRT-PCR的所有引物Tab.1 All primers for qRT-PCR

1.3 数据分析

所有荧光实时定量PCR试验数据采用SPSS 17.0软件处理，结果以平均值±标准误表示。通过单因素方差分析和t检验进行组间差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 高粱LKR蛋白的保守结构域分析

在EnsemblPlants中得到基因的ID为SORBI-3004G321800，LKR基因定位在高粱10条单倍染色体的第4条染色体上（4：65684804-65695905），正义链。通过分析发现，高粱LKR蛋白含有AlaDh PNT-N、Saccharop dh-N、Sacchrp dh-NADP、Sacchrp dh-C等4个保守域；有2个转录物，分别为KXG31271和EES05910，这2个 转 录 物 都 有25个外显子和20个结构域，并且都有4个Pfam（登录号分 别 为PF05222、PF04455、PF03435、PF16653）。本研究选择序列号为EES05910作分析对象。AlaDh PNT-N结构域位于基因的19～156 bp处，属于CL0325家族，是丙氨酸脱氢酶N-末端结构域；Saccharop dh-N结构域位于基因的477～574 bp处，是LOR/SDH双功能酶的保守区域；Sacchrp dh-NADP结构域位于583～711 bp处，属于CL0063家族，是酵母氨酸脱氢酶NADP结合域；Sacchrp dh-C结构域位于基因的715～1 053 bp处，属于CL0139家族，是酵母氨酸脱氢酶C-末端结构域（图1）。

图1 高粱与水稻、玉米、谷子、小麦LKR蛋白的保守结构域Fig.1 Conserved domains of LKR proteins in sorghum，rice，corn，millet，and wheat

2.2 高粱LKR蛋白结构预测

对高粱LKR蛋白的二级结构、三级结构进行预测，结果如图2所示。

图2 高粱LKR蛋白二级和三级结构模型Fig.2 Secondary and tertiary structural models of sorghum LKR protein

结果显示，该蛋白由大量α-螺旋、无规卷曲、β-折叠片和少量β-转角组成，其中，421个氨基酸参与α-螺旋的形成，占氨基酸总数的39.72%；406个氨基酸参与无规卷曲的形成，占比为38.3%；166个氨基酸参与β-折叠片的形成，占比为15.66%；67个氨基酸参与β-转角的形成，占氨基酸总数的6.32%。图2-B为根据同源建模法利用SWISSMODEL预测LKR/SDH蛋白三级结构，得出3个模型，LKR/SDH蛋白与模型1的相似性为67.44%，比其余2个模型更可靠。根据GMQE值越接近1，建模质量越好的原则，选取建模质量最好的模型1，图2-B展示了3个不同角度下LKR/SDH蛋白的折叠情况，为α-β结构类型，这种结构使LKR/SDH蛋白结构较稳定。

2.3 高粱LKR蛋白的理化性质分析

通过Protparam分析可知，高粱LKR蛋白由1 060个氨基酸组成，相对分子量为116 026.54，其中含量较多的3种氨基酸分别为：Leu（112个）占10.6%，Ala（89个）占8.4%，Gly（82个）占7.7%；含量较少的3种氨基酸分别为Trp（3个）占0.3%，Cys（23个）占2.2%，Met（24个）占2.3%。该蛋白不稳定系数为40.89，属于不稳定蛋白质。脂肪族氨基酸系数为92.32，说明编码该蛋白的氨基酸多为脂肪族氨基酸。该蛋白理论等电点为5.58，属于酸性蛋白。

2.4 高粱LKR蛋白亲疏水性、磷酸化位点、跨膜结构、信号肽预测

图3-A结果显示，该蛋白的亲水性氨基酸稍多于疏水性氨基酸，为亲水蛋白。由图3-B可知，高粱LKR蛋白上具有94个磷酸化位点，其中，磷酸化位点最多的是丝氨酸（45个），其余是苏氨酸（37个）和酪氨酸（12个）。同时预测出LKR蛋白上有14种蛋白激酶位点，分别是：ATM、CKI、CKII、DNAPK、EGFR、GSK3、INSR、PKA、PKC、PKG、SRC、cds、cdk5和p38MAPK。高粱LKR蛋白以结合丝氨酸和苏氨酸磷酸化的PKA和PKC位点为主。根据图3-C得知，该蛋白是非跨膜蛋白。图3-D显示，高粱LKR蛋白没有信号肽，所以，属于非分泌蛋白。

图3 高粱LKR蛋白理化性质预测Fig.3 Prediction of physical and chemical properties of sorghum LKR protein

2.5 高粱LKR蛋白亚细胞定位预测

根据PSORTII Prediction对高粱、水稻、玉米、谷子和小麦LKR蛋白进行亚细胞定位预测，由表2可知，高粱LKR蛋白主要定位在细胞质膜（占比34.8%），其次是内质网（占比30.4%）、液泡（占比17.4%）。水稻LKR蛋白主要定位在细胞质膜（占比22.2%）、内质网（占比22.2%）和液泡（占比22.2%）。玉米LKR蛋白主要定位在内质网（占比44.4%）。谷子LKR蛋白主要定位在内质网（占比33.3%），其次是细胞质膜（占比22.2%），在高尔基体、细胞质、液泡和线粒体中分布一样多（均占比11.1%）。小麦LKR蛋白主要定位在细胞质（占比26.1%），此外也预测分布在囊泡（占比17.4%）、细胞核（占比13.0%）、线粒体（占比13.0%）等中。

表2 高粱与水稻、玉米、谷子、小麦LKR蛋白的亚细胞定位Tab.2 Subcellular localization of LKR protein in sorghum，rice，corn，millet，and wheat %

2.6 禾本科LKR基因染色体定位分析

高粱LKR基因定位在高粱4号染色体上，起始于65 684 895 bp，终止于65 695 917 bp（图4）。小麦LKR基因分别定位在A、B、D染色体组的第6号染色体上。谷子LKR基因定位在1号染色体上，起始于39 932 924 bp，终止于39 945 100 bp。水稻LKR基因定位在水稻第2号染色体上，起始于33 260 120 bp，终止于33 264 235 bp。玉米LKR基因定位在4号染色体上，起始于180 805 091 bp，终止于180 816 424 bp。

图4 高粱与小麦、谷子、水稻、玉米LKR基因染色体定位Fig.4 Chromosome location of LKR gene in sorghum，wheat，millet，rice，and corn

2.7 高粱LKR蛋白系统进化树分析

在NCBI的蛋白数据库中下载高等植物LKR基因序列，用MEGA 7.0邻接法构建系统发育进化树。与LKR基因亲缘关系最近的是玉米（94.33%）和谷子（90.2%），其次是水稻（83.51%）和小麦（83.03%）。已有11个物种LKR基因被报道，如水稻、小麦、玉米、大麦、黄花蒿、木豆、苜蓿、可可树、美洲棉、甜杏仁等。这些物种被聚为三大类，分别为单子叶植物中的禾本科、双子叶植物中的菊科和蔷薇科（图5）。

图5 不同植物的LKR蛋白系统进化发育树分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of LKR protein in different plants

2.8 高粱LKR基因在种子不同发育时期的表达分析

取高粱生长至抽穗开花期，在授粉后5、10、15、20、25 d采集的 种子，通过qRT-PCR测定了高粱LKR基因的相对表达量（图6）。结果表明，LKR基因在种子发育的不同时期呈现先上升后下降的趋势，在授粉20 d时的表达量最高，且与其他发育时期差异显著。

图6 LKR基因在种子发育不同时期表达量分析Fig.6 Analysis of LKR gene expression at different stages of seed development

3 结论与讨论

赖氨酸酮戊二酸脱氢酶（LKR）是赖氨酸降解的关键酶[6]。通过对高粱LKR蛋白的保守结构域和系统进化的分析，得出高粱LKR蛋白与禾本科植物水稻的保守结构域非常相似，说明这些禾本科植物的LKR基因进化也同样保守。通过分析得知，高粱LKR蛋白是一种亲水且不跨膜的非分泌蛋白，并具有较多的丝氨酸和苏氨酸的磷酸化位点。到目前为止，从单子叶植物玉米[29-30]、水稻[31]以及双子叶植物大豆[9]、菜豆[10]中纯化和鉴定了LKR/SDH蛋白，并在拟南芥[32-33]、玉米[34-35]等植物中探究了其在赖氨酸分解代谢途径方面的作用，证实酵母氨酸途径中赖氨酸先分解为酵母氨酸再分解为2-氨基己二酸的步骤是由LKR/SDH蛋白催化完成的，并且能够影响种子中赖氨酸积累的效率[36-37]。

在模式植物拟南芥中，通过Southern Blot分析与原位杂交，结果显示，LKR/SDH基因在不同器官组织中如幼苗、花、叶、茎和根中表达模式不同，在花和发育的种子的胚中表达显著上调[38]。用玉米授粉20 d后的根、叶、胚和胚乳中的总RNA与ZmLKR/SDH特异性探针杂交，结果显示，ZmLKR/SDH主要在内胚层中表达，根、茎和叶中少量表达[39]。用抗ZmLKR/SDH抗体进行Western Blot分析发现，LKR/SDH蛋白主要在种子中表达，根、茎、叶、花或愈伤组织不表达[40]。在水稻中的研究表明，OsLKR/SDH在开花后表达量依次是14 d>21 d>28 d>7 d。通过Western Blot测定了玉米F1授粉18、25、32、40、48、56 d后，LKR/SDH蛋白在胚和胚乳中的积累。结果显示，LKR/SDH蛋白的表达受父母本遗传影响，主要在成熟后期（32 d）表达[41]。本试验采用qRT-PCR检测高粱籽粒授粉后25 d内不同发育时期LKR基因的表达量，结果表明，LKR基因的表达量依次为：20 d>25 d>5 d>10 d>15 d。这与玉米、水稻中的研究结果相似。本研究为利用基因工程调控高粱LKR/SDH蛋白的表达来提高种子赖氨酸含量提供了理论基础。