佛手蒸制前后对大鼠燥性指标及血液代谢的影响 Δ

聶沁馨 ，张秋霞 ，汪金玉 ，伍沛君 ，贺亚丽 ，林鸿彬 （.广州中医药大学中药学院，广州 50006；.广州实验室药物与疫苗研究部，广州 50005）

佛手为芸香科植物佛手Citrus medica L. var. sarco‐dactylis Swingle的干燥果实，具有疏肝理气、和胃止痛、燥湿化痰的功效，用于治疗肝胃气滞、胸胁胀痛、胃脘痞满、食少呕吐、咳嗽痰多等疾病。《本草便读》记载：“佛手，理气快膈，惟肝脾气滞者宜之，阴血不足者，亦嫌其燥耳”[1]，明确指出佛手具有燥性。燥是中药的固有性能之一，具有治疗作用与副作用。其治疗作用指用于治疗湿证；其副作用指根据“燥性伤阴”的中医理论，认为燥性干涩，最易伤人津液，临床表现为口干口渴、大便秘结、小便短少等症状[2―3]。在岭南地区，临床使用的佛手饮片多为蒸制后的制佛手，《广东省中药炮制规范》（1984年版）记载佛手的炮制作用为“蒸后降低辛燥之性”[4]。

科属亲缘关系相近的植物，常含有结构类型相似的次生代谢产物。因此，研究佛手的燥性，可考虑通过参照其同科属燥性中药枳壳来开展。枳壳源自芸香科柑橘属植物，现代研究报道枳壳生品具有较强的燥性，会对机体的津液造成一定损伤，研究常选用饮水量、排尿量、肾水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）含量等作为枳壳的燥性评价指标[5―6]。代谢组学技术在中药炮制相关科研中已有较为广泛的应用，如通过代谢组学研究何首乌“九蒸九晒”炮制后肝毒性降低的机制[7]、揭示柴胡醋制后增强保肝作用的内在原因[8]。研究蒸制对佛手药效的影响，可以先对比考察佛手蒸制前后对机体代谢物的影响，因为机体的许多生命活动，如能量传递、细胞信号释放、细胞间通信等都会受到代谢物的调控。本研究以枳壳为阳性对照，参考枳壳的燥性评价指标，观察佛手不同饮片对大鼠摄食量、饮水量、尿液量、AQP3等燥性指标的影响，以探究佛手致燥的特点；同时，采用代谢组学技术，寻找生、制佛手给药干预后大鼠体内潜在的差异代谢物及代谢通路，以期为佛手蒸制前后药效变化研究提供科学思路。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用的主要仪器有TGL-16MS型台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司），SB-5200DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），ACQUITY UPLC Ⅰ-Class型超高效液相色谱仪、VION IMS Q-TOF型高分辨质谱仪（美国Waters公司），UPH型台上式超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

生佛手饮片（批号171101）、枳壳饮片（批号170505）均购自广州至信药业股份有限公司，经广州中医药大学中药学院陈康教授鉴定为真品，分别来自芸香科植物佛手C. medica L. var. sarcodactylis Swingle的干燥果实、芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.或其栽培变种的干燥未成熟果实。AQP3试剂盒（批号201809）购自大连美仑生物技术有限公司；L-2-氯苯丙氨酸购自上海恒创生物科技有限公司；色谱级甲醇、甲酸、乙腈均购自德国CNW公司。

1.3 动物

本研究所用动物为SPF级SD大鼠，雄性，体质量180～220 g，购自广州中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号为SCXK（粤）2013-0034。所有动物均饲养于广州中医药大学（大学城）实验动物中心SPF级动物房，实验动物使用许可证号为SYXK（粤）2013-0085。

2 方法

2.1 制佛手的制备

称取生佛手饮片1 kg，淋润蒸馏水（蒸馏水质量为生佛手饮片质量的20%），隔水蒸制，待圆气后蒸制2.5 h，自然冷却至室温取出，于50 ℃恒温干燥箱烘干，取出，密封保存，备用[4]。

2.2 药液制备

取生佛手饮片50 g，分别以料液比1∶20和1∶15加入蒸馏水煎煮2次，第1次45 min，第2次30 min，合并2次煎煮液，水浴加热浓缩至200 mL，得生佛手药液，分装后冷冻保存。制佛手、枳壳药液的制备方法同上。

2.3 给药与分组

根据2020年版《中国药典》，佛手和枳壳每日最大用量均为10 g，根据人与动物之间药物剂量换算关系，以成人60 kg为标准体质量计算，大鼠每日给药剂量约为1.2 g/kg。佛手性较温和，在前期预实验基础上，本研究将生、制佛手的每日给药剂量均设为正常剂量的2倍（2.4 g/kg），枳壳的每日给药量则为正常剂量（1.2 g/kg）。

将24只大鼠随机分为4组，分别为空白组、生佛手组、制佛手组、枳壳组，每组6只。适应性喂养1周后，给药组大鼠分别灌胃相应药液（相当于生佛手2.4 g/kg、制佛手2.4 g/kg、枳壳1.2 g/kg），空白组大鼠灌胃等体积蒸馏水，连续35 d。每日记录大鼠摄食量、饮水量，分别于给药第0、7、14、21、28、35天记录一次体质量并收集大鼠尿液。至第35天末次给药后麻醉，腹主动脉取血，冷冻离心，取上层血清，保存于－80 ℃备用。

2.4 大鼠血清AQP3的检测

采用ELISA法检测。取“2.3”项下血清样品，以酶标仪于450 nm波长处测定各孔的光密度（OD）值，并计算其中AQP3的含量。操作过程严格按照试剂盒说明书操作。

2.5 代谢组学分析

2.5.1 代谢组学样本制备 取“2.3”项下血清样品，室温下解冻后取100 μL血清，加入10 μL内标（L-2-氯苯丙氨酸，质量浓度为0.3 mg/mL，甲醇配制），涡旋振荡10 s，再加入300 μL的蛋白沉淀剂甲醇-乙腈（2∶1，V/V），涡旋振荡1 min，冰水浴中超声提取10 min，－20 ℃下静置30 min，在4 ℃条件下以13 000 r/min冷冻离心15 min，取上层清液，即得样本提取液。质控样本由所有样本的提取液取适量等体积混合制备而成。

2.5.2 色谱条件 色谱柱采用ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以0.1%甲酸溶液为流动相A，乙腈-甲醇（2∶3，V/V）溶液（含0.1%甲酸）为流动相B进行梯度洗脱（0～1 min，1%B→30%B；1～2.5 min，30%B→60%B；2.5～6.5 min，60%B→90%B；6.5～8.5 min，90%B→100%B；8.5～10.7 min，100%B；10.7～10.8 min，100%B→1%B；10.8～15 min，1%B）；流速为0.4 mL/min；柱温为45 ℃；进样量为1 μL。

2.5.3 质谱条件 采用电喷雾离子源在正、负离子模式下进行质谱分析。毛细管电离电压为2.5 kV，进样电压为40 V，碰撞电压为6 eV，离子源温度为115 ℃，氮气温度为450 ℃，氮气流速为900 L/h，质谱扫描范围为m/z 50～1 000 Da。

2.6 数据处理与分析

采用SPSS 20.0软件进行数据统计分析，实验结果满足正态分布时以±s表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验（方差齐时）或Dunnett’s T3检验（方差不齐时），检验水准α＝0.05。选择大鼠的血清样本采用液相色谱-质谱联用技术进行分析，对检测样本的基峰离子流图进行可视化检查，将所有原始数据经代谢组学处理软件进行预处理，得到保留时间、m/z和峰强度的数据矩阵。将数据矩阵导入SIMCA 14.0软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares-discrimiant analysis，OPLS-DA）。代谢物用 Progenesis QI软件基于 HMDB（http：//www.hmdb.ca/）、Lipidmaps（https：//www.lipidmaps.org/）公共数据库及自建数据库进行定性。根据P值和代谢物浓度的差异倍数（fold change，FC）筛选差异代谢物，将筛选后的差异代谢物映射到KEGG（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）数据库进行通路分析。

3 结果

3.1 药物对大鼠体质量、摄食量和饮水量的影响

给药第0～35天，各组大鼠体质量平缓上升，各组之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。制佛手组大鼠的摄食量、饮水量均具有高于枳壳组和生佛手组的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠体质量、摄食量和饮水量变化趋势见图1。

3.2 药物对尿液量及血清AQP3含量的影响

给药第7、14天，各组大鼠尿液量差异无统计学意义（P＞0.05）。给药第21天，与空白组比较，枳壳组尿液量显著降低（P＜0.05）；与枳壳组比较，制佛手组尿液量显著升高（P＜0.05），且接近空白组。与空白组比较，各给药组血清AQP3含量均有不同程度的升高，枳壳组血清AQP3含量较空白组显著升高（P＜0.05）；与枳壳组比较，制佛手组血清AQP3含量显著降低（P＜0.05），且接近空白组。结果见表1。

表1 各组大鼠尿液量及血清AQP3含量的测定结果（±s，n＝6）

表1 各组大鼠尿液量及血清AQP3含量的测定结果（±s，n＝6）

a：与空白组比较，P＜0.05；b：与枳壳组比较，P＜0.05

组别空白组枳壳组生佛手组制佛手组尿液量/mL给药第7天11.67±4.23 14.22±5.13 10.93±3.09 12.15±4.46给药第14天13.52±3.27 14.90±5.64 10.13±1.45 11.93±2.85给药第21天14.58±5.58 9.53±3.04a 11.17±1.37 15.98±3.01b给药第28天15.95±6.74 13.18±3.57 11.30±2.06 19.53±7.86给药第35天15.75±6.95 12.63±4.58 11.37±2.54 17.48±8.65血清AQP3含量/（ng/mL）16.30±3.99 27.50±6.40a 22.47±1.19 17.31±3.24b

3.3 大鼠血清代谢组学分析

3.3.1 代谢轮廓分析 采用液相色谱-质谱联用技术对样本进行代谢组学分析，采集正、负离子模式下质控样本的总离子流图，结果见图2。由图2可知，样品中代谢物在较短时间内能被很好地分离。

图2 正、负离子模式下质控样本的总离子流图

3.3.2 PCA 根据PCA得分图（图3）可知，所有质控样本聚在一起，说明样本及分析过程中仪器稳定性良好，模型可靠，所得差异代谢物能够反映样本之间的生物学差异。空白组、生佛手组和制佛手组基本分离，表明生、制佛手给药后均会影响大鼠体内的正常代谢，且佛手炮制前后对大鼠体内代谢的影响存在差异。

图3 各组样本PCA得分图

3.3.3 OPLS-DA 3组OPLS-DA模型中，模型拟合优度参数R2Y分别为1.000、0.991、0.829，预测优度参数Q2分别为0.928、0.947、0.256。空白组与生佛手组、空白组与制佛手组的R2Y、Q2接近于1，说明模型有较高的解释率及预测能力。由图4可知，各组样本之间分离较好，组内样本聚集，说明组间代谢物存在明显差异。

图4 各组样本OPLS-DA模型图

3.3.4 血清差异代谢物筛选 根据OPLS-DA模型筛选组间差异代谢物，以P＜0.05、FC＞3或FC＜1/3作为筛选条件[9]。分析得到制佛手组-空白组差异代谢物有20个，包括10个氨基酸、7个脂类、3个其他类；生佛手组-空白组差异代谢物有3个，均为脂类；生佛手组-制佛手组差异代谢物有3个，包括2个氨基酸类、1个羧酸类，结果见表2。由表2可知，生佛手给药干预后在体内主要影响脂类，而制佛手给药后对脂类的影响降低，向氨基酸类迁移。

表2 大鼠血清中差异代谢物的鉴定结果

3.3.5 代谢通路分析 将差异代谢物进行匹配，得到具有KEGG信号的差异代谢物，通过KEGG pathway mapper功能进行通路富集分析，获得代谢通路富集结果。筛选出P＜0.05的通路，认为该代谢通路有显著性差异。结果显示，生佛手和制佛手均影响了亚油酸代谢和甘油磷脂代谢。从通路P值来看，生佛手对甘油磷脂代谢的影响显著高于制佛手，对亚油酸代谢的影响显著低于制佛手；制佛手组-空白组和生佛手组-制佛手组的组间差异代谢物涉及多条代谢途径，结果见表3。

表3 空白组、生佛手组和制佛手组组间差异代谢物的代谢通路

4 讨论

本研究选用健康大鼠，连续给药35 d，大鼠经历了药物反应蓄积、症状表现和机体自我调节过程。从摄食量、饮水量、尿液量3个指标的动态观察结果可以看出，给药7 d，生、制佛手组间3个指标都出现了分化；给药第14天，两组间摄食量和饮水量分化最大，此后分化出现波动。生佛手组和枳壳组大鼠饮水量较空白组和制佛手组低，然而关于枳壳燥性的文献报道表明，生枳壳组大鼠饮水量会显著高于空白组，文献采用的剂量为10 g/kg[5―6]。本研究枳壳采用剂量为1.2 g/kg（正常剂量），给药剂量不同可能是本研究中饮水量指标结果无显著性的原因。由此也说明以饮水量作为燥性评价指标并不适合所有燥性中药。制佛手组和枳壳组组间的尿液量于给药第21天出现显著性差异，在此前后差异均无统计学意义。血清AQP3在机体发挥的作用主要是促进水在细胞内外的转运，促进肾小管的重吸收[10]。有实验证明，血清AQP3缺少小鼠会出现多尿症状[11]。本研究对大鼠血清AQP3含量的检测结果显示，制佛手组血清AQP3含量显著低于生佛手组（P＜0.05）。相应尿液量观察结果显示，制佛手组尿液量较生佛手组高。由此得出，AQP3含量变化可以有效反映佛手的燥性。佛手的燥可使大鼠机体内血清AQP3含量增加，尿液量减少。综合各项动态观察指标和尿液量与血清AQP3的关联性，推测研究佛手的燥性，给药时长以21 d较为合适。综合本研究中各项燥性相关指标的观察/检测结果，枳壳与佛手具有相似的燥性表征，虽然指标值的转折点出现时间在两者中略有不同，但是不影响以枳壳作为佛手燥性相关研究的阳性对照药。

代谢组学结果显示，制佛手影响的通路涉及不饱和脂肪酸代谢、胰岛素代谢、水液代谢和氨基酸代谢等。胰岛素代谢、水液代谢等多个代谢中均有环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）代谢物的影响，即cAMP-蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）通路受到影响。cAMP是细胞内重要的第二信使之一，目前已被证明可以调节各种细胞进程，例如细胞代谢、增殖、凋亡和基因表达等。cAMP-PKA信号通路还可以介导AQPs的运输、门控及重新分布，腺苷三磷酸在腺苷酸环化酶作用下生成cAMP，cAMP进一步激活PKA或蛋白激酶C，磷酸化活化AQPs，从而增加细胞膜对水的通透性[12]。研究证实cAMP-PKA信号通路的上调可使AQP3表达水平提高[13]。本研究代谢组学结果进一步印证血清AQP3可作为评价佛手燥性的指标之一。

生佛手组-制佛手组涉及的半胱氨酸和蛋氨酸代谢与肝脏内脂质代谢密切相关。蛋氨酸又名甲硫氨酸，能促进磷脂酰胆碱合成，蛋氨酸、胆碱缺乏容易导致磷脂酰胆碱合成减少，造成极低密度脂蛋白的合成、分泌减少及线粒体β-氧化功能损伤，从而使三酰甘油在肝细胞中大量堆积，导致肝细胞脂肪变性，形成脂肪肝[14]。生佛手组-空白组和制佛手组-空白组的差异代谢物均涉及甘油磷脂代谢，且生佛手对甘油磷脂代谢的影响大于制佛手。研究表明，甘油磷脂代谢与酒精性肝损伤引起的早期脂肪变性和炎症有关[15]，因此认为生佛手和制佛手调节肝脏内脂质代谢的作用可能存在差异，后期可通过建立高脂血症动物模型来验证佛手炮制前后药效变化。

综上所述，制佛手可能通过影响cAMP-PKA通路缓和生佛手的燥性，血清AQP3含量可作为评价佛手炮制前后燥性变化的指标；生佛手和制佛手对大鼠血清内源性代谢物的影响存在较大差异，尤其在脂质代谢方面，可为研究佛手炮制前后药效变化提供思路。