呼出气挥发性有机物检测应用于诊断肺部感染的研究进展

陈钊铭，李征途，叶 枫

人类利用呼出气诊断疾病具有十分悠久的历史，古希腊的希波克拉底（公元前460—370 年）首次描述了伤寒与呼出气的关系。18 世纪末，安托万·拉瓦锡发明了现代呼气检测方法，从而发现了氧气和二氧化碳，取代了燃素理论[1]。20 世纪80 年代13C-尿素呼气试验首次用于幽门螺杆菌感染的诊断。经过30 年的发展，尿素呼气试验已被认为是诊断幽门螺杆菌感染的金标准[2]。2011 年，美国胸科协会制定了呼出气一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，FeNO）测定作为一种无创方法来诊断哮喘和监测抗炎治疗疗效的应用指南，并强烈建议使用FeNO测定诊断嗜酸性气道炎症[3]。呼出气挥发性有机物（VOC）检测作为一种新型生物标志物分析方法，促进了呼出气代谢组学在临床中的应用与发展[4]。

1 呼出气VOC 检测应用于肺部感染诊断的原理和方法

人体VOC 的产生与自身新陈代谢有着密切联系，机体在患病状态下，某些代谢通路增强或减弱可导致细胞及周围环境的pH 值发生改变，为了维持内环境平衡，机体会产生相应的化学物质，即VOC 进行中和[5]。血液中的VOC 能通过气体交换经血气屏障到达肺泡，因此肺泡VOC 的浓度可代表血液中的浓度[6]。有学者推测，肺部感染性疾病患者产生的VOC 可能来自3 个方面：宿主生理代谢过程的产物、微生物病原体代谢过程的产物以及宿主抵抗病原体产生免疫应答过程的产物[7]。

呼出气VOC 检测技术依赖于近年来质谱技术的不断发展，主要检测方法可分为直接分析检测和离线分析检测。直接分析法所用质谱技术包括质子转移质谱、选择性离子流动管质谱、离子迁移谱、激光光谱技术、电子鼻技术等。直接分析法可连续监测VOC 的动态变化，不需要预先浓缩或储存呼吸样品，且成本较低。其局限性在于检测范围有限，不支持绝对识别，例如虽然离子迁移谱可根据呼出气成分在电场的行为来识别其成分，电子鼻技术可通过各种排列分布传感器识别信号的改变来区分患者与健康人，但均不能识别单个化合物；选择性离子流动质谱同样不能辨别同分异构体。

离线分析法中气相色谱-质谱联用（GC-MS）是呼出气VOC 检测的“金标准”，其不仅可以分离出呼出气VOC，还可精确进行辨别和定量，但该机器体积庞大且价格高昂，难以实现床旁快速检测。此外，间接分析方法还需要解决样品采集问题，如需对全部气体成分进行分析，可使用Tedlar 气袋或金属罐进行采样。Tedlar 气袋可重复利用，不易泄露，但仅可保存数小时；金属容器密闭性更好，保存时间长，但成本过高且难以清洗。如只需对部分类别的化合物进行靶向分析，通常采用预浓缩的方法进行检测，如热解析法、固相微萃取、分子过滤筛等方法，这些方法亦存在碎片化、灵敏度不高、难以定量等问题[5，8-9]。

2 各种病原体呼出气VOC 检测的研究进展

2.1 细菌

基础研究方面，Bean 等[10]采用二次电喷雾电离质谱技术通过细胞实验和动物实验对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等产生的特异性VOC 进行研究，发现病原体自身能产生部分特异性VOC，且这些VOC 与宿主的免疫应答有关。通过体内、体外VOC 二次电喷雾电离质谱技术指纹图谱比较，发现存在一定的差异性[11-12]。Lawal 等[13]利用人工痰液和营养液培养菌，对其顶空进行采样后通过热解析气相色谱-质谱联用（TD-GC-MS）分析VOC，识别出此前报道的挥发性标志物吲哚和1-十一烯，并检测到新发现的化合物环戊酮和1-己醇。研究者进一步研究了培养基成分，以确定培养基对于VOC 产生的影响，结果显示在不同培养环境下，细菌产生的VOC 存在差异。此外，研究者对A549 Ⅱ型肺泡上皮细胞株分别在有和无铜绿假单胞菌的情况下进行培养，并利用过氧化氢培养A549 细胞，诱导氧化应激反应，研究上皮细胞损伤产生的标志物，发现铜绿假单胞菌产生的VOC 标志物主要为乙醚基化合物[14]。

临床研究方面，研究者利用GC-MS 检测肺部感染患者呼出气VOC，发现呼出气VOC 能有效区分肺部感染患者与非感染者。Filipiak 等[15-17]进行的一项开放性随机临床试验，招募了28 例患严重颅内疾病的机械通气患者，发现感染金黄色葡萄球菌或白念珠菌患者的呼出气VOC 与前期体外研究中相应病原体释放的代谢物重叠，其浓度分布与感染过程相关。Neerincx 等[18]亦发现呼出气VOC 谱可区分感染与非感染肺囊性纤维化患者，并确定了9 种有鉴别意义的重要化合物。有学者对感染鲍曼不动杆菌的呼吸机相关性肺炎患者的呼出气样本进行分析，结果表明通过VOC 谱可以区分患者下呼吸道鲍曼不动杆菌的存在与否，及鲍曼不动杆菌的感染与定植[19]。这些研究显示，将代谢生物标志物从细胞体外研究和动物模型体内研究转移到人体研究是可行的，但在临床使用之前需要进一步完善和验证。

2.2 病毒

病毒VOC 检测目前仍限于细胞和动物实验。一些学者通过GC-MS 检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒[20-21]、呼吸道合胞病毒等感染细胞后产生的VOC，发现这些细胞产生的VOC 中，以酯和其他含氧化合物为主，可能与感染引起的炎性反应及氧化应激增加相关。

Schivo 等[22]将感染鼻病毒的人支气管原代上皮细胞、热灭活的鼻病毒和Toll 样受体（TLR）激动剂poly（I：C）处理的细胞与对照组进行比较，结果显示受感染细胞中脂族醇、支链烃和二甲基硫化物等化合物存在差异表达，这些化合物可能与氧化应激有关。但单纯的TLR3 激动剂无法激活细胞产生相应物质，提示这些标志物的产生与病毒复制相关。

Traxler 等[23]通过GC-MS 对甲型流感病毒感染猪分别在感染前、感染期、康复后对其呼出气VOC 进行分析，发现乙醛、丙醛、乙酸正丙酯、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯和1，1-二丙基丙烷等6种VOC 可能与疾病进展有关。在接种病毒后的第4 天，感染组检测到甲型流感病毒阳性时，对照组与感染组的呼出气VOC 呈现差异。

2.3 曲霉

2-戊基呋喃被认为是曲霉感染患者呼出气VOC 中极为重要的标志物。研究发现，曲霉在血琼脂、营养琼脂和其他培养基上培养可产生2-戊基呋喃[24]。在随后的一项前瞻性观察研究中，通过GC-MS 检测有侵袭、定植曲霉风险的慢性肺部疾病患者及健康人呼吸样本中的2-戊基呋喃，结果发现2-戊基呋喃呼气试验的灵敏度和特异度为77%和78%[25]。有报道显示2 例严重免疫抑制的侵袭性肺曲霉病患者，在其多个呼出气样本中检测到2-戊基呋喃，但经过有效治疗后未再检测到2-戊基呋喃[26]。此外，萜类化合物亦受到人们关注，Koo 等[27]通过TD-GC-MS 对曲霉进行体内、体外呼气试验，发现单萜类化合物α-和β-蒎烯、柠檬烯，倍半萜化合物α-和β-反式香柠檬烯是烟曲霉独特的挥发性代谢产物。Gerritsen 等[28]对曲霉临床分离株和标准株进行培养，进一步利用GC-MS 对其培养基样品进行分析，同时对患者呼出气VOC 进行检测，并将二者的结果进行比较，由曲霉感染可产生1，3-戊二烯、2-甲基-1-丙醇和2-甲基异莰醇等代谢产物。值得注意的是，上述研究中的呼出气样本和培养物中均未检测到2-戊基呋喃，有学者认为2-戊基呋喃可能来源于血红蛋白，由培养基中的血琼脂或者患者肺出血产生，而不是来自真菌本身。生长培养基或分离物的不同亦将导致检测到的VOC 存在差异，例如只有在培养基中添加弹性蛋白时才能检测到倍半萜类化合物。事实证明真菌产生VOC 是一个动态的过程[29]，因此需要在不同时间点采用多种 VOC 组合的方式进行检测，才能更好地将体外实验结果应用于临床试验。

3 呼出气VOC 应用于肺部感染病原体检测的前景

传统的病原体检测方法如培养、血清学和分子检测等常需耗费数小时到数天，甚至需要复杂、有创的采样技术，如支气管肺泡灌洗。因此，呼出气VOC 的检测作为一种无创、快速、灵敏的检测方法，具有一定的应用前景。但仍然存在以下问题需要解决：①背景空气及其个体差异对呼吸成分的影响，这需要更加严格地做好参照及采样的质量控制；②现阶段研究仍缺乏统一标准，不同设备之间一致性及真实性尚需考证；③体内外研究结果的明显差异也提示仍需要对呼出气VOC的产生来源作一步探索。未来呼出气VOC 可作为识别肺部感染病原体的标志物应用于临床，但需要更多的动物实验及临床试验数据进行验证。